【摘要】目的 研究真核翻譯啟動因子eIF4E(eukaryotic initiation factor 4E)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTOR(mammalian target of rapamycin , mTOR)在結直腸癌中的表達和其對應的臨床病理之間相互關系，尋找在大腸癌的發(fā)生、進展過程中eIF4E及mTOR的作用;研究兩者之間的有無關系。方法 外科手術中獲取大腸癌組織及癌旁組織各60例(要求手術患者在手術前未進行全身化療、放療及其他治療)，采用逆轉錄酶聚合酶鏈反應技術及酶聯(lián)免疫法檢測大腸癌組織及癌旁組織中mTOR和eIF4E基因的RNA水平和蛋白水平表達變化。結果 1、分別用RT-PCR法和酶聯(lián)免疫法檢測結果顯示：大腸癌組織中mTOR和eIF4E基因的表達明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。mTOR和eIF4E基因RNA表達與性別、年齡、臨床TNM分期差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，在不同腫瘤分化程度以及有無淋巴結轉移上差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 2.相關性分析顯示mTOR和eIF4E在大腸癌中的表達呈顯著正相關(P<0.05)。結論 mTOR和eIF4E基因的過度表達在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，mTOR和eIF4E基因的表達與大腸癌的分化程度及淋巴結轉移情況有相關性;聯(lián)合檢測兩者在大腸癌中的表達可能有助于惡性程度的評估與預后判斷。

　　【關鍵詞】 大腸癌 mTOR eIF4E 職稱論文

　　大腸癌是發(fā)生于大腸部位的常見的消化道惡性腫瘤，居于消化道道腫瘤的第3位。

　　mTOR 信號通路是細胞內重要的生存信號轉導通路,該通路的激活與腫瘤細胞的增殖、分化、逃避凋亡、耐藥及血管生成密切相關[1]。 哺乳動物雷帕霉素靶(mammalian target of rapamycin , mTOR)和真核細胞翻譯起始因子(eukaryotic initiation factor 4E)是mTOR 信號通路中的兩個重要的分子[2，3]。本實驗擬觀察試圖通過收集大腸癌及癌旁組織中對mTOR 信號通路的mTOR、eIF4E兩個基因的檢測，更進一步完善對大腸癌組織的早期診斷和預后判斷提供一個新的思路。

　　1對象與方法

　　1.1 研究對象

　　收集2010年l0月至2012年6月來自烏海市第三人民醫(yī)院的結腸癌根治術后癌及癌旁標本各60例.其中男28例、女32例，年齡22～80歲，按全國結直腸癌協(xié)作組1986年標準進行組織學分類，其中高分化l6例，中分化26例，低分化18例，TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期分別為13、23和24例，其中淋巴結轉移38例。

　　1.2 實驗方法

　　按一步Trizol法 提取樣本組織的RNA：按說明書配制20ul的RT反應液(反應液配制請在冰上進行)。 1 Total RNA用量為1ug。反轉錄反應條件如下: 37℃ 15 min ， 85℃ 5 sec 按說明書配制50ul的PCR反應液，94 ℃ 30sec ，56 ℃* 15sec ，25Cycle72 ℃ 30sec 。設循環(huán)25個,實驗采用GAPDH片段作為內參照。mTOR、eIF4E、GAPDH引物采用Oligo軟件進行設計，由invitrogen公司合成(具體序列見表一)。取PCR產物5ul，加5xLoading Buffer 2ul，2%瓊脂糖凝膠電泳 110V，100mA，25min，凝膠成像儀成像并保存結果。

　　表1 PCR引物詳細序列：

　　1.3 按酶聯(lián)免疫法(ELISA)試劑盒說明書檢測mTOR,eIF4E基因蛋白表達 計算：根據(jù)標準品的濃度及對應的OD值，計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣本的OD值，在回歸方程上計算出對應的樣品濃度，也可以使用各種應用軟件來計算。最終濃度為實際測定濃度乘以稀釋倍數(shù)。

　　1.4 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)采用表示，組間比較采用t 檢驗，兩組以上比較采用方差分析，相關分析采用直線相關分析法分析。以SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。P <0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

　　2 結 果

　　RT-PCR、Elisa法檢測大腸癌及癌旁組織mTOR、eIF4E基因RNA水平的表達和蛋白表達結果一致。結果顯示：大腸癌mTOR、eIF4E基因表達量結果一致，癌組織明顯高于癌旁組織，差異顯著有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖1，2，表2，4)。相對應內參基因GAPDH表達無差異(見圖3)。大腸癌組織中mTOR、eIF4E基因表達與年齡、性別、TNM分期無關(P>0.05)，與組織分化程度、淋巴結轉移有關(P<0.05)(詳見表3,5)。

　　mTOR基因和eIF4E基因相關性分析：60例大腸癌標本RT-PCR法檢測mTOR基因和eIF4E基因灰度值相關性分析統(tǒng)計處理后結果為：r=0.892，P<0.05，二者呈明顯正相關性。同樣用Elisa法檢測mTOR基因和eIF4E基因OD值相關性分析統(tǒng)計處理后結果為：r=0.563，P<0.05，二者呈明顯正相關性圖-1，2，3mTOR基因 、eIF4E基因 、GAPGH內參 RT-PCR電泳圖

　　表格 2 RT-PCR法大腸癌及癌旁組織mTOR和eIF4E基因總RNA表達:(n=60，)

　　注：*P<0.01 VS 癌旁組

　　表3 eIF4E和mTOR基因RNA的表達與臨床病理特征的關系注：P1為mTOR基因，P2為eIF4E基因

　　表格 4 Elisa法檢測大腸癌及癌旁組織mTOR、eIF4E基因蛋白水平的表達結果((n=60，)。.注：*P<0.01 VS 癌旁組

　　表5 eIF4E和mTOR基因蛋白的表達與臨床病理特征的關系

　　注：P1為mTOR基因，P2為eIF4E基因

　　3 討論

　　結直腸癌是目前最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率表現(xiàn)為明顯上升趨勢。目前結直腸癌的主要根據(jù)Dukes分期或TNM 分期兩種分期方法來進行預后的估計，治療方案的選擇也是主要根據(jù)此分期系統(tǒng)進行的。多基因和多因素的共同作用可能是導致腫瘤的產生、以及進展的因素。其中各種致癌的因素和環(huán)境的因素通過協(xié)同、序貫的方法導致細胞局部可復性的DNA傷害;進一步促發(fā)原癌基因的激活、抑癌基因的滅活，以及凋亡基因、凋亡抑制基因功能的改變，引起腫瘤細胞的惡性生長。目前許多學者認為在腫瘤的發(fā)生、浸潤和轉移過程中發(fā)揮相當重要作用兩個因素是細胞的化生和腫瘤周邊微血管生成[4]。本研究通過RT一PCR和酶聯(lián)免疫法等方法，分別從RNA表達水平及蛋白表達檢測大腸癌及正常組織中mTOR基因的表達，結果顯示：mTOR基因RNA表達水平及蛋白表達無論是在大腸癌組織還是正常組組織中表現(xiàn)為高度一致性，大腸癌癌組織中mTOR基因呈現(xiàn)出過度表達，但是在于正常大腸組織中mTOR表達微弱，與上述有關參考文獻研究結果一致。mTOR基因的RNA表達水平及蛋白表達在兩組中均有顯著統(tǒng)計學意義。mTOR基因的表達量與年齡、性別、TNM分期無關(P>0.05)，與組織分化程度、淋巴結轉移有關(P<0.05)。由此思考本研究可以在大腸癌的診斷及相關預后判斷上提供一定的參考價值。本研究通過逆轉錄聚合酶鏈式反應和酶聯(lián)免疫法兩種方法分別檢測RNA水平和蛋白表達水mTOR和eIF4E基因在大腸癌組織及正常組織中的表達。結果顯示：mTOR和eIF4E基因在大腸癌組織中同時過度表達，呈明顯正相關，與此同時，mTOR和eIF4E基因在大腸癌旁組織中同時低表達或者表達缺失，同樣呈明顯正相關。說明mTOR的過度激活導致了eIF4E的表達上調，從而可能成為大腸癌的形成的關鍵原因之一。有上述結果可以大膽猜想，同時抑制mTOR和eIF4E基因的表達及其相關生物性活性極有可能成為預防和或治療大腸癌的有效途徑之一，本實驗為創(chuàng)新大腸癌的治療提供一個新的思路以及一點相應的生物學依據(jù)。mTOR信號通路主要通過兩種信號通路調控細胞的生長和增殖：PI3K/Akt依賴型途徑和PI3K/Akt非依賴型途徑[5]。被激活后的mTOR可以調節(jié)其兩條處于下游的通路：核糖體S6蛋白激酶)和真核細胞始動因子4E 結合蛋白1(4EBP1)。目前4EBPl 和S6K1 是最深入研究的mTOR 的底物，它們是蛋白翻譯的關鍵調節(jié)因子[6]。其中4EBP1 是mTOR 的第一個下游底物，是一種翻譯抑制因子，它通過與翻譯啟動因子4E(eIF4E,eukaryotic translation initiation factor4E)的結合而抑制翻譯啟動抑制蛋白翻譯[7]。正常情況下，eIF4E和其抑制物4E-BPs的結合形成復合物，從而不能觸發(fā)帽依賴性翻譯;而激活后的mTOR使其下游引物4EBPs磷酸化后,導致eIF4E和4EBPs的分離,從而解除對翻譯的抑制作用[8] ?？赡苁悄[瘤形成的原因之一。

　　4 結論

　　mTOR和eIF4E的異常表達在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，mTOR和eIF4E

　　的表達與大腸癌的分化程度及淋巴結轉移情況有關;聯(lián)合檢測兩者在大腸癌中的表達有助于惡性程度的評估與預后判斷。

　　參考文獻

　　[1] LazaLffs—karatzas A，S Kathleen，Sonenberg N：Malignant transformation by an eukaryotic initiation factor subunit that binds to mRNA 5’cap.Nature 1990，345：544—7

　　[2] Marotrigianl J，Gingras AC，Sonenberg N，Burley SK：Cocrystal structure of the messenger RNA 5’cap—binding protein(elF4E)bound to 7-methyl—GDP.Cell 1 997，89：95 1·6 1

　　[3] Sarbassov DD，Aii SM，Kim DH，et a1. Rictor，a novel binding partner of mTOR, defines a rapamycin-insensitive and raptor-independent pathway that regulates the cytoskeleton [J]. Curr Biol，2004，14(14)：1296-1302

　　[4] Lewis JD，Izaurralde E：The role of the cap structure in RNA processing and nuclear export.Eur JBiochem 1997，247：461—9

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　　[8] Zhou W, Quah ST, Verma CS, Liu Y, Lane DP, Brown CJ.Improved eIF4E Binding Peptides by Phage Display Guided Design: Plasticity of Interacting Surfaces Yield Collective Effects[J].Public library of science one.2012;7(10)