〔摘要〕 目的 研究婦科千金膠囊對小鼠脾淋巴細胞體外增殖及免疫調節的影響。方法 分離制備小鼠脾淋巴細胞，將細胞分為空白組(不做任何處理)，刀豆蛋白A組(刀豆蛋白A干預，ConA組)，LPS組(脂多糖干預，LPS組)及不同濃度的婦科千金膠囊組(FKQ)，作用時間分別為24 h、48 h和72 h。CCK8法檢測FKQ對小鼠脾淋巴細胞體外增殖的影響;MTT法檢測ConA及LPS對脾淋巴細胞增殖的影響;流式細胞術檢測各組小鼠脾淋巴細胞中CD4+和CD8+的比例并計算CD4+/CD8+的比值;ELISA檢測各組細胞上清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的表達。結果 FKQ對小鼠脾淋巴細胞有顯著的增殖作用，以濃度為30、40、50 μg/mL時其作用越明顯(P<0.01);FKQ能對ConA誘導的T淋巴細胞及LPS誘導的B淋巴細胞增殖有著明顯的促進作用，以濃度為50 μg/mL最顯著(P<0.01);中、高濃度的FKQ協同ConA能升高CD4+的比例，降低CD8+的比例，顯著升高CD4+/CD8+的比值(P<0.01)。此外，不同濃度的FKQ均能明顯增加IFN-γ及IL-2的表達(P<0.01，P<0.05)，降低IL-4和IL-10的水平，以中、高濃度最為顯著(P<0.01)，調節Th1/Th2平衡。結論 婦科千金膠囊可有效促進脾淋巴細胞增殖，升高CD4+和CD8+比例，促進Th1細胞因子的分泌，使Th1/Th2亞群向“Th1漂移”，調節Th1/Th2平衡，提高細胞免疫應答。

　　〔關鍵詞〕 婦科千金膠囊;脾淋巴細胞;增殖;免疫調節;Th1/Th2

　　婦科千金膠囊(FKQ)是中國中藥保護品種，收載于2015版《中華人民共和國藥典》一部，由千斤拔、金櫻根、穿心蓮、單面針、功勞木、雞血藤、當歸、黨參8味中藥材組成，具有清熱除濕、益氣化瘀的功效。常用于濕熱瘀阻所致的帶下病、腹痛，癥見帶下量多、色黃質稠、臭穢、小腹疼痛、腰骶酸痛、神疲乏力等，既標本兼治，又扶正祛邪，臨床上廣泛用于婦科炎癥，療效甚佳。方中千斤拔祛風利濕解毒，金櫻根清熱利濕止帶，二者同為君藥;穿心蓮和功勞木清熱除濕，二者同為苦寒之品，合用使全方清熱解毒之力增強;單面針以其辛溫之性，可防穿心蓮、功勞木過于苦寒而傷胃，使全方藥性更趨平和，無傷正氣之虞，三者共為臣藥。當歸補血活血、調經止痛，雞血藤補血、活血、通絡，二者合用既能補血調經，又能暢利血行而加強全方清熱除濕、活血解毒之功能;黨參補中益氣、生津養血，與當歸、雞血藤合用氣血雙補、扶正固本，使全方融扶正、祛邪為一體，三者共為佐藥。諸藥合用使機體正氣得以充養，邪氣得以祛除，故諸癥消除。

　　中醫學十分重視人體的正氣，強調正氣是發病的主導，認為“正氣存內，邪不可干;邪之所湊，其氣必虛”。意指當人的正氣在內，氣血充足的時候，即機體免疫力正常，“外邪”即致病菌不容易侵犯機體致病;而當人體正氣受損，即免疫功能低下時，致病菌容易乘虛而入發病。FKQ的治療理念在清除致病菌的同時增強機體免疫力，后期通過強化自身免疫能力而防治疾病反復發作。脾臟作為機體最大的外周免疫器官，是T、B淋巴細胞的主要聚集場所，而T、B淋巴細胞作為機體免疫活性細胞，其激活、分化、增殖在免疫應答過程中起著重要的作用[1]。關于FKQ能調節由環磷酰胺引起的小鼠免疫功能障礙及FKQ組分中藥對機體免疫調節研究較多[2-5]，但尚無FKQ對體外培養小鼠脾淋巴細胞的免疫增強活性的報道。因此，本實驗以FKQ為研究對象，研究其對小鼠脾淋巴細胞的增殖及免疫調節的影響，以期為FKQ提高免疫作用機制的研究及開發利用奠定理論依據。

　　1 材料

　　1.1 實驗動物

　　20只健康BALB/c雌性小鼠，體質量16～18 g，6～7周齡，由湖南斯萊克景達實驗動物公司提供，許可證號：SCXK(湘)2019-0004。實驗動物飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心，自由飲食飲水，實驗程序由湖南中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準。

　　1.2 藥品與試劑

　　婦科千金膠囊(FKQ)(產品批號20170231，株洲千金藥業股份有限公司);CCK8(CA1210，北京索萊寶科技有限公司);胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(16000-044，美國gibco公司);1640培養基(C11875500BT，美國gibco公司);DMEM高糖培養基(SH30022.01，Hyclone公司);ConA刀豆蛋白、LPS脂多糖及MTT噻唑蘭(批號分別為C8110、L8880、M8180，北京索萊寶科技有限公司);Mouse IFN-γ、IL-2、IL-4及IL-10 ELISA Kit(批號為PI508、PI575、PI612、PI522，上海碧云天生物技術有限公司)。

　　1.3 儀器

　　47103離心機(Eppendorf中國有限公司);SW-CJ-2FD蘇州凈化超凈工作臺(上海葉拓科技有限公司)、Blender 快速組織細胞破碎儀(美國 NextAdvance 公司)、Cyto-Flex 流式細胞儀(美國Beckman公司)。

　　2 方法

　　2.1 小鼠脾臟細胞的分離

　　將小鼠腹腔麻醉后，頸椎脫臼處死，75%酒精將小鼠浸泡15 min;在超凈臺中取出小鼠脾臟，去除筋膜后反復用PBS沖洗至無血色;將脾臟置于200目細胞篩上，注射器研磨，用PBS沖洗6次后置于培養皿中;收集細胞懸液，1 500 r/min離心10 min，棄上清;加入10%紅細胞裂解液適量，室溫靜置10 min，1 500 r/min離心10 min，棄上清;PBS清洗3遍，1 500 r/min離心10 min，棄上清;加入0.85%NaCl溶液重懸沉淀;密度梯度離心加樣，1 800～2 000 r/min離心40 min;收集目標分層，PBS清洗3遍;RPMI-1640完全培養基重懸細胞沉淀，調節細胞濃度為1×108，轉入培養瓶中37 ℃、5%CO2孵育3 h，去除貼壁細胞，收集懸浮細胞進行后續實驗。

　　2.2 CCK8法檢測FKQ對脾淋巴細胞的增殖作用

　　將FKQ設置成10、20、30、40、50 μg/mL，不同藥物濃度孵育小鼠脾淋巴細胞24 h、48 h和72 h。將處理完成的細胞制備細胞懸液，將1×104的細胞數接種到96孔板中，每孔約100 μL細胞懸液，每個濃度設3個復孔，培養12 h使其貼壁。每孔加入10 μLCCK8繼續培養1 h后，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度，吸光度值與細胞的增殖能力成正比。

　　2.3 MTT法檢測FKQ對ConA誘導脾淋巴細胞增殖的影響

　　細胞分離、接種方法同前，參考文獻[6]，本實驗分為空白組，模型組(ConA，5 μg/mL)，FKQ組：不同濃度的FKQ(10、30、50 μg/mL)分別干預ConA誘導脾淋巴細胞。于37 ℃，5%CO2培養箱中作用24 h、48 h和72 h，MTT法檢測FKQ對ConA誘導脾淋巴細胞增殖功能，測定方法同CCK8法。

　　2.4 MTT法檢測FKQ對LPS誘導的脾淋巴細胞增殖的影響

　　細胞分離、接種方法同前，參考文獻[7]，本實驗分為空白組，LPS組(LPS，10 μg/mL)，FKQ組：不同濃度的FKQ(10、30、50 μg/mL)分別干預LPS誘導的脾淋巴細胞。于37 ℃，5%CO2培養箱中作用24 h、48 h和72 h，MTT法檢測LPS誘導脾淋巴細胞增殖功能。

　　2.5 流式細胞術檢測小鼠脾淋巴細胞中CD4+和CD8+亞群的變化

　　將脾淋巴細胞(1×108)加入24孔板，設空白組、ConA組(ConA，5 μg/mL)和FKQ組：不同濃度的FKQ(10、30、50 μg/mL)分別干預ConA誘導脾淋巴細胞。每組均有3個復孔，置于37 ℃、5%CO2培養箱中，孵育48 h，離心收集細胞，磷酸鹽緩沖溶液清洗，然后使用小鼠單克隆抗體CD4+-FITC或者CD8+-FITC孵育后磷酸鹽緩沖溶液清洗，流式檢測CD4+和CD8+的百分比。

　　2.6 ELISA法檢測細胞上清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的含量

　　將脾淋巴細胞(1×108)加入96孔板，設空白組(不做任何刺激)、ConA組(ConA刺激)、LPS組(LPS刺激)和FKQ組：不同濃度的FKQ(10、30和50 μg/mL)分別干預ConA誘導脾T淋巴細胞和LPS誘導脾B淋巴細胞，每組均有3個復孔，置于37 ℃、5%CO2培養箱中，孵育48 h，收集細胞上清，2 000 r/min室溫離心5 min，取上清，按說明書操作，經酶標儀測定OD值。

　　2.7 統計學處理

　　使用SPSS 22.0統計學軟件整理數據，計量資料以“x±s”表示，當數據符合正態分布時，多組間比較使用單因素方差齊性分析(One-way ANOVA)，當P<0.05時差異有統計學意義。

　　3 結果

　　3.1 FKQ對脾淋巴細胞的增殖作用

　　對小鼠脾淋巴細胞分別孵育24 h、48 h和72 h后，結果發現，當細胞孵育24 h，濃度為10、20 μg/mL的FKQ對小鼠脾淋巴細胞增殖無差異(P>0.05);濃度在30、40、50 μg/mL時對細胞增殖有著顯著的促進作用(P<0.01)。當孵育細胞48 h，與濃度為10 μg/mL的FKQ相比，濃度在20、30、40、50 μg/mL時能明顯增加脾淋巴細胞增殖(P<0.01)，且隨著劑量的增加其增殖作用越明顯。細胞孵育72 h后，30 μg/mL的FKQ對細胞增殖有促進作用(P<0.05);40、50 μg/mL的FKQ對細胞增殖促進作用更為明顯(P<0.01)。其他濃度組的細胞存活率無顯著性差異，說明各濃度組藥物對細胞無明顯毒性。與培養24 h相比，FKQ濃度為10、30、50 μg/mL時，培養48 h與72 h，對小鼠脾淋巴細胞增殖無影響(P>0.05);FKQ濃度為20、40 μg/mL時，培養48 h時能明顯促進細胞增殖(P<0.01)。見表1。

　　3.2 FKQ對ConA誘導脾T淋巴細胞增殖的影響

　　由表2可知，與ConA組相比，10～50 μg/mL的FKQ對T淋巴細胞的增殖具有顯著性差異(P<0.01)，有顯著的量效關系，但只在24 h時劑量依賴性最明顯;細胞孵育48 h及72 h時，FKQ濃度在10 μg/mL和30 μg/mL時對細胞增殖作用差異較小，而當其濃度達到50 μg/mL時，其差異變化較大。

　　3.3 FKQ對LPS誘導脾B淋巴細胞增殖的影響

　　由表3可知，LPS在不同的孵育時間對B淋巴細胞都有明顯增殖促進作用;10～50 μg/mL的FKQ對B淋巴細胞的增殖存在明顯差異(P<0.05，P<0.01)，在細胞孵育24 h及72 h時劑量依賴性最明顯;當細胞孵育24 h及72 h時，FKQ濃度在10 μg/mL和30 μg/mL時對細胞增殖作用差異較小，而當其濃度達到50 μg/mL時，其差異變化較大。當細胞孵育48 h時，FKQ濃度在10 μg/mL和30 μg/mL時對細胞增殖作用差異最大，濃度在50 μg/mL時，其差異最小。

　　3.4 FKQ對小鼠脾淋巴細胞中CD4+和CD8+亞群的影響

　　如圖1所示，與對照組相比，在ConA的刺激下，CD4+ T細胞比例顯著升高(P<0.01)，而隨著FKQ的濃度升高CD4+ T細胞的比例出現增加的趨勢，但低濃度FKQ與ConA協同效果不明顯，而當FKQ達到中、高濃度時開始與ConA產生協同作用(P<0.01);經ConA刺激后CD8+ T細胞比例降低;中、高濃度FKQ協同ConA能顯著升高CD4+/CD8+比值，調節機體免疫功能(P<0.01)。說明中、高濃度的FKQ與ConA能產生協同作用，調節機體免疫平衡。

　　3.5 FKQ對小鼠脾淋巴細胞INF-γ、IL-2、IL-4及IL-10表達的影響

　　表4結果顯示，與空白組相比，單用ConA和LPS刺激均能顯著增加IFN-γ、IL-2的含量，差異具有統計學意義(P<0.01，P<0.05);與單用ConA及LPS刺激相比，ConA協同50 μg/mL FKQ能促進IL-2的表達，LPS協同不同濃度的FKQ對IFN-γ、IL-2的表達均有顯著促進作用(P<0.01)，同時結果發現，與空白組相比，ConA及LPS的刺激顯著降低了細胞中IL-4的表達(P<0.01，P<0.05)，而增加IL-10的表達(P<0.01)。與單用ConA及LPS刺激相比，FKQ協同ConA、LPS刺激均能降低IL-4、IL-10的表達，尤以中、高濃度最為顯著(P<0.01)。

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