〔摘要〕 目的 探索扶正活血解毒方對(duì)檳榔堿提取物(areca nut extract， ANE)誘導(dǎo)的口腔黏膜下纖維化(oral submucous fibrosis， OSF)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的作用機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)大鼠口腔黏膜上皮細(xì)胞(epithelial cell， EC)，分為正常組、模型組、中藥高/中/低劑量組和IWR-1組。以ANE為誘導(dǎo)劑，扶正活血解毒方含藥血清為干預(yù)藥物，以Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑IWR-1為陽(yáng)性對(duì)照物，采用CCK8檢測(cè)EC細(xì)胞增殖;PCR檢測(cè)Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1基因的表達(dá);Western blot檢測(cè)Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與正常組相比，模型組EC增殖水平提高，Wnt1、β-catenin、cylinD1基因及蛋白表達(dá)增加，Axin基因及蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與模型組相比，中藥高、中劑量組EC增殖水平降低，Wnt1、β-catenin、cylinD1基因及蛋白表達(dá)降低，Axin基因及蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與模型組相比，IWR-1組EC增殖水平降低，Wnt1、β-catenin、cylinD1基因及蛋白表達(dá)降低，Axin基因及蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。結(jié)論 扶正活血解毒方可通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路，抑制ANE刺激的EC增殖，逆轉(zhuǎn)OSF癌前病變的形成。

　　〔關(guān)鍵詞〕 口腔黏膜下纖維化;檳榔堿提取物;扶正活血解毒;Wnt/β-catenin信號(hào)通路

　　口腔黏膜下纖維化或稱口腔黏膜下纖維性變(oral submucous fibrosis， OSF)是一種口腔黏膜潛在惡性疾病[1-2]。其癌變率高達(dá)7%，WHO將OSF列為癌前狀態(tài)[3]。流行病學(xué)調(diào)查表明，咀嚼檳榔是OSF主要的致病因素，但癌變機(jī)制尚不清楚，可能與檳榔的致癌成分檳榔堿、細(xì)胞因子、創(chuàng)傷及細(xì)胞免疫等關(guān)系密切[4-5]，尤其認(rèn)為某些細(xì)胞因子參與了OSF的癌變過(guò)程，其中以Wnt與TGF-β1介導(dǎo)的信號(hào)通路最具代表性[6-8]。如何阻斷TGF-β與Wnt信號(hào)通路細(xì)胞因子間的聯(lián)系，將成為防治OSF癌變的關(guān)鍵。前期研究發(fā)現(xiàn)扶正活血解毒中藥通過(guò)調(diào)控TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能具有抑制檳榔堿提取物(areca nut extract， ANE)刺激的EC細(xì)胞增殖的作用[9-11]。本研究將從Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的角度探討扶正活血解毒方對(duì)OSF癌前病變的作用機(jī)制，為臨床OSF癌變的防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 口腔黏膜上皮細(xì)胞(epithelial cell， EC)購(gòu)自于中國(guó)上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司。收到細(xì)胞后，選擇相差顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，鏡下細(xì)胞為多角形，胞核大，培養(yǎng)皿中細(xì)胞鋪滿的位置顯微鏡下可見鋪路石狀。高倍鏡下未見成纖維細(xì)胞。

　　1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 (1)檳榔提取物(ANE)購(gòu)于深圳潤(rùn)慧生物科技有限公司。(2)扶正活血解毒方所用藥物為顆粒劑，由廣東三九制藥有限公司生產(chǎn)，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。具體組方規(guī)格如下：丹參10 g，玄參10 g，當(dāng)歸10 g，紅花5 g，生地黃10 g，白花蛇舌草10 g，夏枯草10 g，生黃芪10 g，薄荷10 g，白芍10 g，茵陳10 g，桔梗10 g。克數(shù)為生藥劑量，為同一批次同一產(chǎn)地藥材。將以上中藥按處方量取14劑，一劑生藥(共115 g)加入500 mL溫開水沖泡并充分?jǐn)嚢瑁褂盟鍧饪s的方法將藥物濃縮成500 mL液體，生藥濃度為0.23 g/mL，藥物現(xiàn)配現(xiàn)用。

　　1.1.3 含藥血清 8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠20只由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，在SPF條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。將大鼠隨機(jī)分為正常組、中藥高劑量組、中藥中劑量組和中藥低劑量組4組，每組5只，其中正常組以0.9%生理鹽水組灌胃8 mL/只，中藥高、中、低劑量組分別按照活扶正活血解毒方12、8、4 mL/kg灌胃[中藥低、中、高劑量大鼠灌胃量按照成人每日用量的1、2、3倍定為等效劑量(正常成人體質(zhì)量按60 kg進(jìn)行換算)]，每日2次，連續(xù)灌胃7 d。大鼠末次灌胃1 h后，行心臟取血，4 ℃、1 500 r/min離心10 min，取上清56 ℃滅活30 min，將滅活后的血清通過(guò)0.22 μm濾器過(guò)濾除菌，配置成完全培養(yǎng)基備用[12-13]。

　　1.1.4 主要試劑 大鼠口腔黏膜上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)液(上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)RATiCELLM013);胰酶(美國(guó)Hyclone，批號(hào)SH30042.01);2.24 μg/mL DispaseⅡ酶(美國(guó)Gibco，批號(hào)25200-027);PBS(美國(guó)Hyclone，批號(hào)SH30256.01B);CCK8增殖檢測(cè)試劑盒(日本DOJINDO，批號(hào)CK04);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國(guó)北京康為世紀(jì)，批號(hào)CW2569);Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(日本TOYOBO，批號(hào)QPK-201);引物由Genecopoeia合成;Wnt1抗體(英國(guó)Abcam，批號(hào)ab15251);β-catenin抗體(英國(guó)Abcam，，批號(hào)ab32572);Axin2抗體(英國(guó)Abcam，批號(hào)ab32197);cylinD1抗體(英國(guó)Abcam，批號(hào)ab251892);IWR-1(美國(guó)MCE，批號(hào)HY-12238);羊抗兔二抗(英國(guó)Abcam，批號(hào)ab6747);顯色液(美國(guó)Cyanagen，批號(hào)23423)。

　　1.1.5 主要儀器 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司，型號(hào)UniCelDxI 800);Nanno Drop 分光光度計(jì)(美國(guó)賽默飛世爾科技公司，型號(hào)NDoneC);基因擴(kuò)增儀(美國(guó)MjRE-SEARCH公司，型號(hào)TTC-220);離心機(jī)(中國(guó)湖南湘儀，型號(hào)H1650R);Motic顯微鏡(成貫儀器上海有限公司，型號(hào)BA210T);酶標(biāo)儀[美谷分子儀器(上海)有限公司，型號(hào)SpectraMax M4]。

　　1.2 方法

　　1.2.1 細(xì)胞分組及培養(yǎng) 分離培養(yǎng)的細(xì)胞增殖至對(duì)數(shù)期，將細(xì)胞分為正常組、模型組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組、IWR-1組6組。其中正常組以正常大鼠血清干預(yù)，模型組以正常大鼠血清+50 μg/mL ANE干預(yù)，中藥高、中、低劑量組分別以高、中、低劑量含藥血清+50 μg/mL ANE干預(yù)，IWR-1組以正常大鼠血清+5 μmol/L IWR-1。

　　1.2.2 CCK8檢測(cè)EC細(xì)胞增殖 將6組細(xì)胞按105/mL濃度接種于96孔板中，每孔100 μL，共鋪5板，檢測(cè)時(shí)間為12、24、36、48 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在檢測(cè)前2 h加入CCK8 10 μL/孔，37 ℃ 5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)至檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，取出培養(yǎng)板，放置于酶標(biāo)儀中，450 nm和600 nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)并讀數(shù)[14-15]。

　　1.2.3 PCR檢測(cè)Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1基因的表達(dá) 將6組細(xì)胞按105/mL濃度接種于T25培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶，將其消化、離心、棄上清留存細(xì)胞。以RNA提取試劑盒提取細(xì)胞RNA，具體操作步驟根據(jù)試劑盒中的使用說(shuō)明進(jìn)行。RNA提取后，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作步驟根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。再根據(jù)反應(yīng)體系將cDNA與SYBR溶液配比，進(jìn)行PCR操作，并讀取mean CT值和△△CT值

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