常言道牙疼不是病疼起來真要命，是的牙疼的醫學管理新治治療方式有那些呢，要如何來治療和預防呢，本文是一篇醫藥論文。牙齦卟啉單胞菌能利用多種毒力因子如半胱氨酸蛋白酶(常指牙齦素)、菌毛和脂多糖侵襲牙周組織和宿主免疫系統。維生素D是保持骨骼健康，調節機體免疫、炎癥反應的重要元素，不僅與鈣吸收、破骨細胞活性密切相關，還參與調節基因表達、蛋白合成和免疫/炎癥反應。本實驗的目的就是研究維生素D對牙齦卟啉單胞菌誘導的人牙周膜細胞炎癥反應的影響。

　　摘要：目的：初步探討維生素D對牙齦卟啉單胞菌誘導的人牙周膜細胞炎癥反應的抑制作用，為牙周病的防治提供一定的依據。方法：采用酶聯免疫吸附實驗、實時熒光定量核酸擴增檢測系統檢測維生素D對牙齦卟啉單胞菌誘導的人牙周膜細胞分泌炎癥因子白介素1β、腫瘤壞死因子α水平的影響。結果：維生素D對牙齦卟啉單胞菌誘導的人牙周膜細胞分泌炎癥因子白介素1β、腫瘤壞死因子α有顯著的抑制作用，最低有效濃度為6.25μg/ml，且隨著維生素D濃度的增加，抑制作用越明顯。結論：維生素D是一種潛在的防治牙周炎癥反應的藥物。

　　關鍵詞：維生素D,牙周炎,醫藥論文

　　牙周炎是以炎癥因子滲出、牙周支持組織破環為主要病理表現的慢性、廣泛性炎癥反應，是成人失牙的首要原因。已被醫學界定論為繼癌癥、心腦血管疾病之后，威脅人類身體健康的第三大殺手，也是口腔健康的“頭號殺手”。流行病學研究結果顯示牙周炎是加重心血管疾病、Ⅱ型糖尿病等多種系統性疾病進程，影響預后的重要誘因[1]。發病機制與免疫、炎癥反應密切相關。現已證實革蘭氏陰性厭氧菌――牙齦卟啉單胞菌是慢性牙周炎發生、發展的主要病原菌，約占牙周炎患者95%以上的病變活動區域[2]。

　　論文范例：《青海醫藥雜志》，《青海醫藥雜志》1958年創刊，能貫徹黨的出版方針政策，實行理論和實踐相結合，以高、中、初三級結合，以臨床醫學、預防醫學等為組稿重點，面向基層，面向臨床的原則，主要刊登地方病、常見病、多發病的防治經驗，以及醫學基礎理論、醫療科研成果，是醫務工作者一畦不可缺少的學術園地。

　　一、材料和方法

　　1.1 材料

　　維生素D代謝物1，25-二羥維生素D3[1，25(OH)2D3]購自Sigma公司，牙齦卟啉單胞菌購自四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室。1，25-二羥維生素D3溶液的配置：將晶體用95%的乙醇配置成10mg/ml的母液，置于-20℃冰箱中儲存備用。使用時用細胞培養液稀釋成各種濃度梯度(100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.5625μg/ml)的工作液。

　　1.2 實驗方法

　　1.2.1 實驗菌液的準備、細菌復蘇及培養：將牙齦卟啉單胞菌ATCC33277菌株復蘇并接種于含有20μM氯高鐵血紅素和0.0001%維生素K的Todd-Hewitt肉湯(THB-HK)中，在37℃厭氧環境下(CO2 10%、N2 90%)培養48h，經形態學鑒定后傳代培養24h，備用。

　　維生素D(vitamin D )為固醇類衍生物，具抗佝僂病作用，又稱抗佝僂病維生素。目前認為維生素D也是一種類固醇激素，維生素D家族成員中最重要的成員是VD2(麥角鈣化醇)和VD3(膽鈣化醇)。維生素D均為不同的維生素D原經紫外照射后的衍生物。植物不含維生素D，但維生素D原在動、植物體內都存在。維生素D是一種脂溶性維生素，有五種化合物，對健康關系較密切的是維生素D2和維生素D3。它們有以下三點特性：它存在于部分天然食物中;人體皮下儲存有從膽固醇生成的7-脫氫膽固醇，受紫外線的照射后，可轉變為維生素D3。適當的日光浴足以滿足人體對維生素D的需要。

　　1.2.2 人牙周膜成纖維細胞的培養：采取酶消化原代培養法。刮取臨床因正畸或阻生拔除牙齒的根中1/3的健康牙周膜，立即投入含三抗的D-Hanks內。清洗刮取的牙周膜，去除血污及不需要組織。加入0.1%膠原酶37℃消化30min，加入含10%FBS的DMEM終止消化，二層無菌紗布濾除組織塊，1 000ppr 5min離心去上清，加入含10%FBS的DMEM進行培養。4～8代用于實驗。

　　1.2.3 維生素D對人牙周膜成纖維細胞活性的影響：消化離心收集人牙周膜細胞，臺盼藍計數調整細胞密度為106/ml接種于96孔板中，培養2h待細胞貼壁后添加不同濃度的維生素D和厭氧培養了24h的牙齦卟啉單胞菌的菌液，繼續孵育72h。接著每孔添加10μl MTT溶液置于細胞培養箱中培養4h，再每孔添加100μl溶解溶液孵育過夜。最后使用分光光度儀進行讀數。

　　1.2.4 牙齦卟啉單胞菌誘導人牙周膜成纖維細胞發生炎癥反應：消化離心收集人牙周膜細胞，臺盼藍計數調整細胞密度為106/ml接種于24孔板中，培養過夜。次日，在孔板中添加200μl不同濃度的維生素D置于培養箱中繼續培養2h。將厭氧培養了24h的牙齦卟啉單胞菌的菌液轉移至塑料離心管，10 000ppr，10min，4℃離心，棄上清液后用含1%FBS的DMEM清洗2次。測 OD660，并根據孔板內牙周膜細胞密度計算感染倍數(multiplicity of infection， MOI)為100時，所需細菌混懸液體積(OD660=1表明細菌密度為2.5×109/ml)。將感染倍數為100的菌液添加到孔板中，繼續培養24h后收集培養液置于-20℃冰箱中保存備用。使用Trizol裂解細胞，酚/氯仿法提取細胞總RNA置于-80℃冰箱中保存備用。

　　1.2.5 ELISA檢測IL-1β、TNF-α蛋白的表達：按ELISA試劑盒產品說明書步驟操作：使用標準品繪制標準曲線，取反應板加樣、并按說明依次加入一抗、酶標抗體及底物工作液，最后加入反應終止液，于酶標儀以波長450nm讀取各孔光密度值。通過標準曲線和ELISAcalc軟件計算各樣本含量。

　　1.2.6 qPCR檢測IL-1β、TNF-αmRNA的表達：提取的總RNA經濃度測定、純度鑒定后，逆轉錄為cDNA，按照反應體系依次添加SYBR Green染料、引物、dNTP、cDNA、Taq酶及去離子水，配制PCR反應溶液。置于Real-time PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：95℃3min預變性，然后按照95℃30s變性，58℃1min退火，72℃1min，共40做個循環，最后72℃7min延伸。

　　二、結果

　　2.1 維生素D對人牙周膜成纖維細胞活性的影響

　　如圖1所示：與空白對照組相比，牙齦卟啉單胞菌組牙周膜成纖維細胞的增殖被顯著抑制，當維生素D濃度為3.125和6.25μg/ml時，牙齦卟啉單胞菌引起的細胞毒性作用非常顯著。可見，牙齦卟啉單胞菌顯著抑制人牙周膜成纖維細胞的增殖，當維生素D濃度≥12.5μg/ml能減弱牙齦卟啉單胞菌引起的細胞毒性。單純的維生素D不影響人牙周膜成纖維細胞的活性。

　　2.2 維生素D對牙齦卟啉單胞菌誘導的IL-1β、TNF-α表達水平的影響

　　ELISA及qPCR檢測結果均顯示牙齦卟啉單胞菌顯著增加人牙周膜成纖維細胞分泌IL-1β和TNF-α，當維生素D濃度≥6.25μg/ml時，能顯著抑制牙齦卟啉單胞菌誘導的炎癥介質的分泌(如圖2、3)。

　　三、討論

　　維生素D是由暴露于紫外線的皮膚合成或從日常飲食中直接獲取的開環甾類化合物。具有鈣化醇(維生素D2)和膽鈣化醇(維生素D3)兩種形式。這兩種形式的維生素均在肝臟代謝為25-羥基維生素D并在腎臟被1-羥化酶轉化為其活性形式1，25-二羥維生素D。因此本實驗選取維生素D的活性形式作為研究試劑。

　　牙周炎伴隨的牙槽骨破壞主要起源于病原菌誘導的過強炎癥反應。IL-1β和TNF-α是破骨細胞活化的主要因子。馬寧等人在大耳白兔牙周組織注射IL-1β、TNF-α，能成功建立典型而穩定，近似臨床牙周炎表現的實驗動物模型[4]。尹麗媛等采用RT-PCR技術檢測成人牙周炎患者牙齦組織中IL-1β、TNF-αmRNA表達水平的結果顯示：其在病變牙齦的表達強度顯著高于正常牙齦，因此推測IL-1β、TNF-α表達與牙周炎發病機理密切相關，有效抑制其分泌與合成有利于牙周炎的治療與預后[5]。本實驗研究結果顯示牙齦卟啉單胞菌能顯著增加人牙周膜細胞分泌、合成IL-1β和TNF-α，誘導細胞炎癥反應，能在細胞水平模擬牙周炎的病理狀態。

　　流行病學觀察顯示牙周健康與維生素D的攝入量密切相關。與每日攝入≥800IU的人群相比，攝入量≤400IU的人群更容易罹患重度牙周疾病并伴隨中重度的牙槽骨破壞[6]。25-羥基維生素D和1，25-二羥維生素D血清濃度偏低者牙周炎和牙喪失的發病率更高[7-8]。維生素D不僅能夠增加骨密度，抑制骨吸收，減少牙喪失[9- 10]，還能通過其抗炎活性發揮免疫調節作用[11-12]。本實驗研究結果也顯示1，25-二羥維生素D能顯著抑制牙齦卟啉單胞菌誘導的IL-1β和TNF-α的分泌。盡管大量研究顯示維生素D在保持骨密度，減少慢性炎癥疾病等方面作用顯著，但是維生素D缺乏和不足在人群中仍然廣泛存在。因此政府呼吁不同年齡段的人群每日口服維生素D 200-600IU[13]。此外，適當日光浴、進食富含維生素D的食物如魚肝油均是有效的途徑。