摘 要：為了解魚(yú)糜加工副產(chǎn)物(魚(yú)頭、魚(yú)骨、魚(yú)鱗、魚(yú)鰭等)酶解物的添加對(duì)凍融鰱魚(yú)魚(yú)糜品質(zhì)及凝膠特性的影響，對(duì)酶解物的體外抗氧化性及反復(fù)凍融魚(yú)糜的鹽溶性蛋白含量、巰基含量、Ca2+-ATP酶活性、表面疏水性、凝膠特性、凝膠持水性及色澤進(jìn)行研究。結(jié)果表明：與其他酶相比，經(jīng)胰蛋白酶及堿性蛋白酶酶解后，魚(yú)糜加工副產(chǎn)物酶解物的體外抗氧化活性最強(qiáng);與對(duì)照組及蔗糖添加組魚(yú)糜相比，魚(yú)糜加工副產(chǎn)物酶解物的添加能夠有效減緩反復(fù)凍融后魚(yú)糜肌原纖維蛋白的冷凍變性及氧化速率，魚(yú)糜的鹽溶性蛋白含量、巰基含量、Ca2+-ATP酶活性較高，表面疏水性較低;同時(shí)，魚(yú)糜加工副產(chǎn)物酶解物的加入增強(qiáng)了魚(yú)糜凝膠的初始凝膠特性及持水性，并能夠有效延緩魚(yú)糜凝膠破斷力、凹陷度及凝膠強(qiáng)度的劣變，改善魚(yú)糜凝膠的持水性。

　　關(guān)鍵詞：魚(yú)糜加工副產(chǎn)物;酶解物;魚(yú)糜品質(zhì);反復(fù)凍融;凝膠特性

　　推薦閱讀：《肉類研究》Meat Research(月刊)1987年創(chuàng)刊，是面向國(guó)外公開(kāi)發(fā)行的行業(yè)科技期刊，全面報(bào)道肉類加工領(lǐng)域科技成果和行業(yè)資訊，是肉類行業(yè)科研人員、管理人員的最愛(ài)讀本。

　　魚(yú)糜是魚(yú)肉肌原纖維蛋白的加工產(chǎn)物，因其良好的口感與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值深受消費(fèi)者喜愛(ài)[1]。傳統(tǒng)的魚(yú)糜制品加工以海洋魚(yú)類為原料，但由于近年來(lái)海洋漁業(yè)資源的匱乏以及淡水魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，以淡水魚(yú)為原料的魚(yú)糜制品開(kāi)發(fā)與研究得到廣泛關(guān)注[2-3]。鰱魚(yú)，又稱白鰱、水鰱等，2016年世界總產(chǎn)量約為530 萬(wàn)t，在世界魚(yú)類產(chǎn)量中排名第2位[4]。鰱魚(yú)由于具有產(chǎn)量高、價(jià)格低廉及營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，被視為良好的魚(yú)糜加工替代品[5]。魚(yú)糜加工通常以魚(yú)肉為原料，約50%～60%的副產(chǎn)物，如魚(yú)頭、魚(yú)骨、魚(yú)鱗、魚(yú)鰭等往往被棄去，造成大量的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染問(wèn)題[6]。這些副產(chǎn)物作為廉價(jià)且優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來(lái)源，可以通過(guò)酶解等生物技術(shù)進(jìn)行深加工，得到的蛋白質(zhì)酶解物能夠添加至魚(yú)糜中，改善魚(yú)糜制品的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[7-9]。因此，魚(yú)糜加工副產(chǎn)物酶解物的開(kāi)發(fā)具有良好的研究?jī)r(jià)值和發(fā)展前景。

　　為延緩肌原纖維蛋白的降解及氧化，魚(yú)糜的貯藏一般以凍藏為主，然而由于冷鏈監(jiān)控的不健全及魚(yú)糜貯運(yùn)等環(huán)節(jié)的溫度波動(dòng)，魚(yú)糜極易發(fā)生多次凍融循環(huán)，最終影響魚(yú)糜的品質(zhì)及凝膠形成能力[10-11]，因此，如何控制魚(yú)糜在凍藏及凍融過(guò)程中的品質(zhì)劣變是當(dāng)今的研究熱點(diǎn)之一。目前的研究主要關(guān)注植物源的抗凍及抗氧化劑開(kāi)發(fā)，如魔芋葡甘聚糖[12]、蘋果多酚[13]等已被證實(shí)具有減緩水產(chǎn)品蛋白質(zhì)冷凍變性及抑制蛋白質(zhì)氧化的效果;通過(guò)生物酶解技術(shù)得到動(dòng)物源蛋白質(zhì)酶解物，如太平洋無(wú)須鱈魚(yú)肌肉酶解物[14]、歐洲鰉魚(yú)魚(yú)皮酶解物[15]等同樣具有抗凍及抗氧化作用，然而，淡水魚(yú)中相關(guān)研究很少[7]。本研究以鰱魚(yú)魚(yú)糜加工副產(chǎn)物(魚(yú)頭、魚(yú)骨、魚(yú)鱗、魚(yú)鰭等)為研究對(duì)象，通過(guò)酶解技術(shù)(堿性蛋白酶、胰蛋白酶)制得魚(yú)糜加工副產(chǎn)物酶解物，探討酶解物的體外抗氧化活性(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除能力、亞鐵離子螯合能力)并將酶解物加入魚(yú)糜中，了解酶解物對(duì)反復(fù)凍融魚(yú)糜的蛋白質(zhì)降解、氧化、凝膠形成能力、持水性等的影響，以期為魚(yú)糜加工副產(chǎn)物的高值化利用及魚(yú)糜制品的品質(zhì)控制技術(shù)提供有效思路。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料與試劑

　　36 條新鮮鰱魚(yú)(體長(zhǎng)(55.05±1.15) cm，體質(zhì)量(1 947±90) g)購(gòu)于北京健翔橋水產(chǎn)市場(chǎng)。

　　胰蛋白酶(205 000 U/g)、堿性蛋白酶(280 000 U/g)、胃蛋白酶(42 500 U/g)、木瓜蛋白酶(245 000 U/g)、中性蛋白酶(135 000 U/g)及風(fēng)味蛋白酶(26 000 U/g) 丹麥Novozymes公司;DPPH、啡啰嗪 美國(guó)Sigma公司;其余試劑購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司;所有試劑均為分析純。

　　1.2 儀器與設(shè)備

　　UV-2600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;T18高速分散均質(zhì)機(jī) 美國(guó)IKA公司;CT-3質(zhì)構(gòu)儀 美國(guó)Brookfield公司;KDY-9820半自動(dòng)凱氏定氮儀 北京通潤(rùn)源機(jī)電儀器設(shè)備公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 鰱魚(yú)預(yù)處理

　　鰱魚(yú)經(jīng)敲擊頭部致暈后，去鱗、頭、內(nèi)臟，取魚(yú)片清洗后備用。魚(yú)頭、魚(yú)骨(含部分魚(yú)肉)、魚(yú)尾、魚(yú)鱗、魚(yú)皮等魚(yú)糜加工副產(chǎn)物收集后斬成小塊，置于-20 ℃冰箱備用。

　　1.3.2 魚(yú)糜加工副產(chǎn)物酶解物的制備

　　鰱魚(yú)魚(yú)糜加工副產(chǎn)物稱質(zhì)量后，加入4 倍體積的蒸餾水，于121 ℃條件下加熱2 h提取蛋白質(zhì)。待蛋白質(zhì)提取液冷卻至室溫后過(guò)3 層濾網(wǎng)，收集上清液旋蒸濃縮后凍干，凍干粉的蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測(cè)定[16]。將已知蛋白質(zhì)含量的凍干粉與去離子水混合(1∶20，m/V)，調(diào)節(jié)底物溶液溫度及pH值至蛋白酶最適條件后，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解1 h后取上清液90 ℃加熱20 min滅酶、離心(5 000 r/min，15 min)后收集上清液并冷凍干燥，得到的粉末即為魚(yú)糜加工副產(chǎn)物酶解物。實(shí)驗(yàn)前期對(duì)6 種鰱魚(yú)魚(yú)糜加工副產(chǎn)物酶解物(所用酶分別為胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶及堿性蛋白酶)的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，最終選擇抗氧化性最強(qiáng)的2 種酶解物：胰蛋白酶及堿性蛋白酶酶解物添加至魚(yú)糜中。

　　1.3.3 魚(yú)糜加工副產(chǎn)物酶解物抗氧化活性測(cè)定

　　DPPH自由基清除能力及亞鐵離子螯合能力的測(cè)定參考Li Xue等[17]的方法。

　　1.3.4 魚(yú)糜制備及凍融循環(huán)

　　魚(yú)糜的制備參考Zhang Longteng等[5]的方法并稍作改動(dòng)。取魚(yú)片上的魚(yú)肉并絞碎，稱質(zhì)量后加入4 倍體積的冷卻蒸餾水(4 ℃)，于低溫條件下攪拌1 h進(jìn)行第1次漂洗，漂洗時(shí)間為30 min;第2次漂洗將漂洗液更換為3 g/L氯化鈉溶液，漂洗液體積和漂洗時(shí)間與第1次相同。漂洗后，利用3 層80 目篩網(wǎng)過(guò)濾漂洗液，取濾網(wǎng)上層魚(yú)糜，通過(guò)擠壓魚(yú)糜調(diào)整其水分含量至78%，分裝。CK組魚(yú)糜不添加抗凍劑;S組魚(yú)糜添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的蔗糖;TS及AS組魚(yú)糜分別將體外抗氧化性最好的魚(yú)糜加工副產(chǎn)物胰蛋白酶及堿性蛋白酶酶解物添加至魚(yú)糜中部分替代蔗糖(TS組：2%魚(yú)糜加工副產(chǎn)物胰蛋白酶酶解物+2%蔗糖;AS組：2%魚(yú)糜加工副產(chǎn)物堿性蛋白酶酶解物+2%蔗糖)。所有組別魚(yú)糜置于-18 ℃條件下凍藏，每隔1 周凍融1 次(置于4 ℃冰箱至中心溫度達(dá)到4 ℃)，共凍融6 次，取凍融第0、2、4、6次的魚(yú)糜進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。

　　1.3.5 魚(yú)糜肌原纖維蛋白提取及鹽溶性蛋白含量測(cè)定

　　1.4 數(shù)據(jù)處理

　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3 次平行測(cè)定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Origin 9.0軟件作圖，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著性水平為P<0.05。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 魚(yú)糜加工副產(chǎn)物酶解物的抗氧化活性

　　脂質(zhì)及蛋白質(zhì)氧化是引起肉類貯藏與加工過(guò)程中品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)特性劣變的重要因素，過(guò)渡金屬離子(Fe2+、Cu2+等)及活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)是引發(fā)肉類制品氧化反應(yīng)的必要條件[21]。

　　由表1可知：魚(yú)糜加工副產(chǎn)物胃蛋白酶酶解物的抗氧化活性最弱;與木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶相比，經(jīng)堿性蛋白酶及胰蛋白酶處理的魚(yú)糜加工副產(chǎn)物酶解物具有良好的體外抗氧化活性，堿性蛋白酶酶解物的DPPH自由基清除率最高，達(dá)60.41%，而胰蛋白酶酶解物的亞鐵離子螯合率最大(93.82%)，表明2 種酶解物均能夠通過(guò)打斷自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及螯合過(guò)渡金屬離子，從而有效抑制氧化反應(yīng)。通過(guò)生物酶解技術(shù)，一些疏水性氨基酸，如苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等從天然蛋白質(zhì)中暴露出來(lái)，它們能夠作為質(zhì)子供體終止自由基傳遞，打斷氧化反應(yīng);酸性或堿性氨基酸，如谷氨酸、賴氨酸等則通過(guò)螯合過(guò)渡金屬離子起到抗氧化作用[22]。Wiriyaphan等[23]同樣發(fā)現(xiàn)，金線魚(yú)魚(yú)糜加工副

　　產(chǎn)物酶解物(所用酶為堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶及Virgibacillus sp. SK33蛋白酶)具有清除自由基及螯合金屬離子的抗氧化作用。

　　2.2 魚(yú)糜加工副產(chǎn)物酶解物對(duì)反復(fù)凍融魚(yú)糜鹽溶性蛋白含量的影響

　　魚(yú)肉的蛋白質(zhì)主要由水溶性肌漿蛋白、鹽溶性肌原纖維蛋白及不溶性肌基質(zhì)蛋白組成，其中肌原纖維蛋白占魚(yú)肉蛋白質(zhì)含量的50%～60%，是決定魚(yú)糜制品品質(zhì)和加工特性的最重要蛋白質(zhì)[24]。

　　由圖1可知，各組魚(yú)糜的鹽溶性蛋白含量初始值約為140 mg/g。隨著凍融次數(shù)的增加，各組魚(yú)糜的鹽溶性蛋白含量呈現(xiàn)不斷降低的趨勢(shì)，凍融6 次后，CK組魚(yú)糜鹽溶性蛋白含量?jī)H為38.76 mg/g，與初始值相比下降約73.76%。魚(yú)糜凍融過(guò)程中因冰晶生成導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的變化及疏水性氨基酸暴露，加速了蛋白質(zhì)之間的氧化交聯(lián)、變性聚集及蛋白質(zhì)溶解性的降低，因此鹽溶性蛋白含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[15，19]。4%蔗糖的添加有效抑制了肌原纖維蛋白的冷凍變性，與初始值相比，S組魚(yú)糜鹽溶性蛋白含量?jī)H降低44.58%。與CK組相比，魚(yú)糜加工副產(chǎn)物胰蛋白酶及堿性蛋白酶酶解物的加入(TS、AS組)同樣減緩了肌原纖維蛋白冷凍變性的速率，凍融6 次后，鹽溶性蛋白含量分別為64.85、82.25 mg/g。魚(yú)糜加工副產(chǎn)物酶解物中的親水性氨基酸，如谷氨酸、賴氨酸等能夠通過(guò)與魚(yú)糜中水分以非共價(jià)鍵結(jié)合，減少冰晶的形成，從而阻礙蛋白質(zhì)的冷凍變性進(jìn)程。