摘要：隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的快速發(fā)展，關(guān)聯(lián)分析成為近些年來在植物數(shù)量性狀研究和植物良種選育中行之有效的分析方法。利用關(guān)聯(lián)分析在分子水平闡明植物表型性狀的遺傳變異規(guī)律和機制，從而為植物的農(nóng)藝性狀改良及新品種選育提供新思路。系統(tǒng)詳實綜述了關(guān)聯(lián)分析基本原理、關(guān)聯(lián)作圖的基本策略、關(guān)聯(lián)分析的應(yīng)用以及各種分子標(biāo)記在關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用，并討論了關(guān)聯(lián)分析在未來研究中的發(fā)展前景。

　　關(guān)鍵詞：關(guān)聯(lián)分析;植物;表型性狀;遺傳變異;農(nóng)藝性狀改良;新品種選育;連鎖不平衡;研究發(fā)展趨勢;應(yīng)用前景

　　《煙臺果樹》(季刊)創(chuàng)刊于1980年，由煙臺市農(nóng)科院果樹科學(xué)研究所主辦。《煙臺果樹》發(fā)行量大(年發(fā)行16萬冊),覆蓋面廣,讀者遍及全國各地,是交流果樹信息的理想媒體。

　　關(guān)聯(lián)分析(association analysis)也稱連鎖不平衡作圖(LD mapping)或者關(guān)聯(lián)作圖(association mapping)，該方法通常以自然群體為研究對象，以連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)為基礎(chǔ)，將目的性狀表型的多樣性以及遺傳標(biāo)記或候選基因的多態(tài)性聯(lián)結(jié)起來分析，鑒定某一群體內(nèi)目的性狀與遺傳標(biāo)記或候選基因之間的關(guān)系[1]。從而在分子水平解釋植物表型性狀的遺傳變異規(guī)律和機制，為植物表型性狀的標(biāo)記輔助選擇以及目的基因的分離、檢測、利用提供依據(jù)，進而為植物性狀遺傳改良研究提供理論基礎(chǔ)，為植物雜交育種和性狀改良尋求新途徑[2]。

　　到目前為止，關(guān)聯(lián)分析已經(jīng)在部分植物性狀研究中取得進展，如玉米的開花期[3]、小麥的籽粒大小和研磨品質(zhì)[4]、水稻的柱頭[5]、葡萄的果穗長度[6]等，關(guān)聯(lián)分析已經(jīng)成為當(dāng)前植物遺傳育種研究的熱點。

　　本文經(jīng)過系統(tǒng)全面的介紹關(guān)聯(lián)分析基本原理以及分析策略，詳細(xì)論述關(guān)聯(lián)分析在目前植物遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用進展以及各類分子標(biāo)記技術(shù)在關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用，探討關(guān)聯(lián)分析在今后的研究發(fā)展趨勢和在植物遺傳研究中的應(yīng)用前景。

　　1 關(guān)聯(lián)分析基本原理

　　1.1 連鎖不平衡

　　關(guān)聯(lián)分析是以連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)為基礎(chǔ)，也可稱為配子相不平衡(gametic phase disequilibrium)、配子不平衡(gametic disequilibrium)、等位基因關(guān)聯(lián)(allelic association)等，是指群體內(nèi)不同座位等位基因(可以是標(biāo)記，也可以是基因/QTL間與標(biāo)記)間的非隨機關(guān)聯(lián)[7]。也就是說假設(shè)2個不同位點的等位基因一同出現(xiàn)的頻率比理論上同時出現(xiàn)頻率高時，那么稱這2個位點處于連鎖不平衡狀態(tài)[8]。LD的基本定義式為Dij=fij-PAi·PBj，其中fij是AiBj基因型的頻率，PAi和PBj分別是等位基因Ai和Bj的頻率。由于Dij可以假定的最大值是所觀察到的等位基因頻率的函數(shù)，因此對于雙等位基因和多等位基因，LD的強度有多種標(biāo)準(zhǔn)化度量，其中2種最常見的LD強度測量方法是：(1)單個LD值的標(biāo)準(zhǔn)化度量，Dij′=Dij/Dmax;(2)雙等位基因數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)r，常用定義為r2=Dij2/(PA1·PA2·PB1·PB2)[9]。同一染色體或者不同染色體的基因座之間均可出現(xiàn)連鎖不平衡狀態(tài)，群體內(nèi)存在的LD均是由突變造成的等位基因出現(xiàn)后座位間所有重組響應(yīng)累積的結(jié)果，位點間連鎖越緊密，其LD程度越高[10]。

　　1.2 影響連鎖不平衡的因素

　　遺傳因素和非遺傳因素綜合作用影響群體的LD水平[11]。一般情況下，在隨機匹配群體里沒有突變、遷移或選擇因素的影響時，多態(tài)性位點則處于連鎖平衡狀態(tài);與此相反，連鎖、群體混合和選擇將增加LD水平[12]。影響LD程度最重要的2個要素是突變和重組，突變是造成LD的一個重要因素，新突變的發(fā)生可沖破原有LD，進而導(dǎo)致新的多態(tài)性產(chǎn)生;然而重組則是經(jīng)過重新組合序列變異，進而減弱染色體內(nèi)部的LD。無連鎖和自由交配的重組使位點間等位基因處于連鎖平衡狀態(tài)，因此LD的水平與重組率成反比[10]。群體中的LD是突變、重組和其他因素影響共同累積的結(jié)果[13]。

　　此外，其他非生物要素和生物要素也影響LD程度，例如物種之間的交配體系、染色體位置、群體大小以及自然與人工選擇[10]。基因轉(zhuǎn)換或染色體片段所受的選擇強度、遺傳漂變[14-15]等也是影響LD水平的因素。

　　1.3 連鎖不平衡與關(guān)聯(lián)分析

　　在自然群體中，表型差異的根本原因主要是個體等位基因間的差異。連鎖分析則是采用標(biāo)記位點與引起表型差異位點之間的重組來定位數(shù)量性狀基因座(quantitativetraitlocus，QTL)，而關(guān)聯(lián)分析利用引起表型差異的位點與標(biāo)記之間的LD來定位QTL[10]。因此，進行關(guān)聯(lián)分析的前提和基礎(chǔ)是了解群體基因組LD的構(gòu)造和規(guī)律。往往因為群體的基因組中存在數(shù)目巨大的多態(tài)性，因此多態(tài)位點的等位基因間存在廣泛的非隨機關(guān)聯(lián)，亦稱為LD狀態(tài)。多個基因座等位基因間的連鎖不平衡結(jié)構(gòu)會產(chǎn)生一系列的單倍型，單倍型的大小則受LD衰減程度的影響。不同物種的連鎖不平衡衰減距離不同，同一物種不同群體、同一群體不同座位的LD衰減距離也不同[16]。染色體上不同位置的連鎖不平衡程度也不相同，研究發(fā)現(xiàn)位于著絲粒附近片段的重組率比較低，LD水平則較高;然而染色體臂上的片段區(qū)域重組率相對較高，相應(yīng)LD水平則較低[17]。連鎖不平衡的衰減程度越高，則形成的單倍型越小。

　　1.4 關(guān)聯(lián)分析與傳統(tǒng)連鎖分析的差異

　　關(guān)聯(lián)分析與傳統(tǒng)連鎖分析相比具有以下優(yōu)勢：(1)關(guān)聯(lián)分析不必構(gòu)建專門作圖群體，而是運用自然群體的遺傳多樣性，將復(fù)雜的性狀變異進行分解。利用關(guān)聯(lián)分析構(gòu)建的群體不須要管制研究對象的交配方式，而傳統(tǒng)的連鎖分析以父母本雜交產(chǎn)生的子代群體為研究對象。相比而言，關(guān)聯(lián)分析可應(yīng)用的種質(zhì)材料更加廣泛。(2)關(guān)聯(lián)分析所研究的材料有較為寬泛的遺傳基礎(chǔ)，因此可同時對同一基因座的多個等位基因進行檢測分析，相比絕大部分傳統(tǒng)連鎖分析，其所研究群體通常為2個親本雜交重組的后代，所以基因座一般只觸及2個等位基因。關(guān)于具備更小效應(yīng)的基因，關(guān)聯(lián)分析的發(fā)掘能力顯著高于傳統(tǒng)連鎖分析[13]。(3)關(guān)聯(lián)分析定位更精準(zhǔn)，能夠抵達(dá)單基因程度，由于關(guān)聯(lián)分析應(yīng)用在長期進化進程中自然群體所積累的重組信息，因而可到達(dá)更高的分辨率，從而達(dá)到對QTL的精準(zhǔn)定位，甚至可直接定位到基因本身[10]。而傳統(tǒng)連鎖分析往往受到重組發(fā)生率的影響，進而導(dǎo)致分辨率較低，一般認(rèn)為初級群體只能將QTL定位到10～20 cM的基因組區(qū)間內(nèi)，而次級群體可達(dá)到單基因水平[18-19]。(4)運用的統(tǒng)計分析方法不同，傳統(tǒng)的連鎖作圖措施包含了單標(biāo)記分析、區(qū)間作圖、復(fù)合區(qū)間作圖以及貝葉斯區(qū)間作圖[13]。與此相比，適用于關(guān)聯(lián)分析作圖的統(tǒng)計方法較為匱乏。

　　2 關(guān)聯(lián)分析的基本策略

　　2.1 基于全基因組掃描的關(guān)聯(lián)分析

　　全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS)是采用自然變異群體，聯(lián)合高密度分子標(biāo)記圖譜進行掃描，進而分析表型性狀與分子標(biāo)記之間關(guān)聯(lián)關(guān)系的有效方法，現(xiàn)已發(fā)展成為發(fā)掘復(fù)雜農(nóng)藝性狀遺傳變異的有效手段[20]。在以全基因組掃描為基礎(chǔ)的的關(guān)聯(lián)分析中，須要用散布于全基因組的高通量分子標(biāo)記對某物種大群體的全部基因進行同時檢測[8]。GWAS以群體中LD水平為基礎(chǔ)，借助成百上千的個體組成的定位群體，采用一定數(shù)量的SNP標(biāo)記構(gòu)建的高密度遺傳圖譜，從而與表型數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)分析。近年來，基于GWAS技術(shù)已在多種植物表型研究中取得一定的進展。代力強等以80份玉米核心自交系為關(guān)聯(lián)作圖群體，通過全基因組測序，篩選出16個與玉米粒長緊密關(guān)聯(lián)的顯著性SNP標(biāo)記和3個候選基因[21]。劉靜利用高密度的小麥90K單核苷酸多態(tài)性(SNP)芯片對西南麥區(qū)192份小麥品種進行株高性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)57個與株高顯著相關(guān)的SNP位點[22]。Feng等利用全基因組測序的472份油菜種質(zhì)，在染色體A03、A05、A07和C07上鑒定出8個QTL與株高顯著相關(guān)，在染色體A01、A03、A07和C07上的5個QTL被鑒定為與主枝數(shù)顯著相關(guān)[23]。目前，基于全基因組關(guān)聯(lián)分析已在各類植物物種深入研究，但在園藝植物中應(yīng)用報道較為匱乏。

　　GWAS一般采用5步進行：(1)關(guān)聯(lián)群體的選擇。應(yīng)選擇遺傳變異豐富、表型差異較大、遺傳基礎(chǔ)較寬泛且應(yīng)盡量包含某物種全部的遺傳變異。(2)樣本基因分型。基于常用的分子標(biāo)記主要包括RFLP、AFLP、SSR及SNP等，隨著全基因測序技術(shù)的不斷發(fā)展，SNP標(biāo)記方法得到廣泛運用。除了使用基因芯片進行基因分型以外，還可直接重新測序獲得研究樣本個體的基因型，進而更加全面地挖掘樣本基因組變異[20]。(3)群體構(gòu)造與個體親緣關(guān)系分析。GWAS通常以自然變異群體為研究對象，存在一定的遺傳結(jié)構(gòu)，其個體間也存在一定的親緣關(guān)系，因而有可能導(dǎo)致染色體間的LD水平提高，使得目標(biāo)性狀與不相關(guān)的標(biāo)記產(chǎn)生偽關(guān)聯(lián)。因此，檢測分析并矯正種質(zhì)材料的群體結(jié)構(gòu)有一定的必要。(4)目標(biāo)性狀的鑒定。目標(biāo)性狀評價的準(zhǔn)確性對于關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果有重要影響，應(yīng)反復(fù)對種質(zhì)材料進行多重表型分析鑒定。(5)關(guān)聯(lián)統(tǒng)計分析模型的選擇。隨著生物統(tǒng)計學(xué)的不斷發(fā)展，關(guān)聯(lián)統(tǒng)計分析模型不斷得到完善，主要包含一般線性模型(GLM)和混合線性模型(MLM)，通常可利用TASSEL軟件或ANOVA計算方法進行關(guān)聯(lián)分析[24]。

　　隨著第3代測序技術(shù)即單分子測序技術(shù)的發(fā)展，植物中主要物種全基因組測序逐步完成，物種的基因組信息越來越豐富，進而開發(fā)出大量的SNP標(biāo)記。全基因組關(guān)聯(lián)分析將成為今后植物數(shù)量性狀研究的有利工具[25]。

　　2.2 基于候選基因的關(guān)聯(lián)分析

　　基于候選基因關(guān)聯(lián)分析主要針對于目標(biāo)QTL區(qū)段內(nèi)候選基因進行生物信息學(xué)分析，推定其生物學(xué)功能是否與數(shù)量性狀表型位于同一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，或是輔以生理生化分析，從而快速確定QTL區(qū)間內(nèi)的候選基因，最終只針對篩選后的少數(shù)候選基因開展關(guān)聯(lián)分析[26]。早在2001年，Thornsberry等初次將關(guān)聯(lián)分析方法引入植物領(lǐng)域研究[27]。根據(jù)前人研究發(fā)現(xiàn)，dwarf8基因是一個與赤霉素的代謝相關(guān)且顯著影響玉米株高的基因[28]，而后Thornsberry等選用92份玉米自交系種質(zhì)對dwarf8基因的多態(tài)性進行驗證，研究表明dwarf8基因不僅影響玉米的株高，而且首次發(fā)現(xiàn)其中幾個多態(tài)性位點與玉米開花期的變異性狀顯著相關(guān)[27]。此項研究發(fā)現(xiàn)意味著基于連鎖不平衡的關(guān)聯(lián)分析可能是進行基因功能驗證以及基因發(fā)掘的一種行之有效的辦法，為植物表型性狀研究提供了新思路[16]。近年來，基于候選基因的關(guān)聯(lián)分析已經(jīng)成功應(yīng)用于部分植物研究。Yu等以295份水稻材料在苗期進行水稻耐鹽相關(guān)表型的全基因組關(guān)聯(lián)研究，獲得了93個候選基因，其中有6個與耐鹽表型具有高關(guān)聯(lián)[29]。Perez等以315份不同高粱材料，利用候選基因關(guān)聯(lián)作圖的方法，檢測油菜素內(nèi)酯生物合成和信號傳導(dǎo)基因與植物結(jié)構(gòu)性狀之前的標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)，共檢測出26個油菜素內(nèi)酯基因的73個SNPs與目標(biāo)表型顯著相關(guān)[30]。于永濤利用94份玉米自交系驗證了rab17基因與玉米籽粒產(chǎn)量相關(guān)聯(lián)[31]。Andersen等利用SNP分子標(biāo)記驗證了PAL基因與玉米飼用品質(zhì)間相互關(guān)聯(lián)[32]。劉翠霞以150份葡萄雜交后代為試驗材料，聯(lián)合RNA-seq技術(shù)初步篩選了32個候選基因參與單萜代謝[33]。國內(nèi)外研究結(jié)果均表明，基于候選基因關(guān)聯(lián)分析是一個進行鑒定候選基因功能的強有力的工具。