摘要：為了解揚州、泰州地區引起奶牛乳房炎的主要病原體，于2015年11月至2017年6月期間對揚州、泰州地區奶牛場送檢的乳房炎奶牛的乳樣進行病原體分離，共分離鑒定出11株無乳鏈球菌菌株，1株乳房鏈球菌菌株。使用卡那霉素、慶大霉素、環丙沙星、氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢西丁、多黏菌素B、紅霉素、四環素、萬古霉素、氧氟沙星、阿奇霉素等藥物進行了耐藥性試驗，結果表明，分離菌對卡那霉素、慶大霉素、氨芐西林和多黏菌素B等藥物有一定的耐藥性，對其他幾種藥物敏感。

　　關鍵詞：奶牛;乳房炎;病原菌;藥敏試驗

　　《江西畜牧獸醫》(雙月刊)創刊于1982年，是由江西省農業廳主管、江西省畜牧獸醫學會和江西省畜牧技術推廣站主辦的刊物。

　　奶牛乳房炎是指病原微生物侵入奶牛乳腺組織或外傷、化學刺激乳腺組織所引起的奶牛乳房炎癥[1]。乳房炎是奶牛最常見的疾病，不僅會影響產奶量和牛奶品質，也因治療時間長、大量使用多種抗生素，造成藥物殘留和細菌耐藥性的產生。我國關于奶牛乳房炎發病率的報道在46%～70%[2，3]。

　　引起奶牛乳房炎病原菌種類較多，有時為多重感染，最常見的是金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌和大腸桿菌[4]。鏈球菌屬致病菌，感染奶牛乳房后所引起的臨床癥狀不明顯，從而不易被牛場察覺，危害極大，最直觀的經濟損失是奶牛乳產量下降，牛奶品質變差。鏈球菌是革蘭氏陽性菌，有莢膜[5]，莢膜及其M蛋白在致病過程中起到重要作用[6]。無乳鏈球菌屬于B群鏈球菌，莢膜多糖、神經氨酸酶等是其重要的毒力因子[7]，一些菌株具有溶血特性。部分β型溶血型鏈球菌致病力強，可引起多種化膿性疾病，產生溶血素、CAMP因子、透明質酸酶和神經氨酸酶等毒性因子[8]。停乳鏈球菌(GCS)為溶血鏈球菌，能分泌透明質酸、O型溶血素和纖維蛋白溶解酶[9]。這些毒力因子在致病過程中起到關鍵作用。

　　為了解揚州、泰州地區奶牛乳房炎的主要病原體，對送檢的牛乳樣本進行了病原分離和鑒定，并進行了耐藥性試驗。

　　1 方法

　　1.1 細菌分離

　　將送檢乳樣無菌接種于綿羊血瓊脂平板，37 ℃培養24 h，觀察是否有菌落生成并進行3次傳代純化，最終記錄菌落結果。

　　1.2 染色鏡檢

　　對分離得到的菌株進行革蘭氏染色，鏡檢。

　　1.3 生化試驗

　　利用細菌微量生化反應管(購于杭州微生物試劑有限公司，操作方法與判定標準參照說明書)對分離所得菌株進行生化指標測定。在37 ℃條件下培養24 h，與對照管比對，觀察反應結果并記錄。

　　1.4 PCR擴增與測序、分析

　　使用TaKaRa 16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit試劑盒對分離株的16s rRNA基因進行擴增。PCR按照試劑盒說明書進行，體系見表1。PCR反應參照試劑盒提供的條件：94 ℃預變性5 min，變性1 min，退火溫度53 ℃ 1 min，72 ℃延伸1 min，再延伸5 min，共30個循環。對擴增產物進行序列測定、BLAST，根據同源性高低確定細菌種屬。

　　1.5 藥敏試驗

　　使用卡那霉素、慶大霉素、環丙沙星、氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢西丁、多黏菌素B、紅霉素、四環素、萬古霉素、氧氟沙星、阿奇霉素等藥物進行分離菌株的耐藥性試驗。

　　2 結果與分析

　　2.1 細菌分離結果和菌落形態

　　牛乳樣本接種血平板，37 ℃培養24 h后長出菌落，挑取菌落進一步鑒定。分離出12株菌落的形態和特征見表2和圖1。

　　2.2 染色鏡檢

　　12株菌株均呈短鏈狀，革蘭氏染色均有不同程度的藍色，為革蘭氏陽性菌，符合鏈球菌的特征。

　　2.3 生化結果

　　對分離的12株鏈球菌菌株進行了生化特性試驗，符合鏈球菌的生化特性，結果見表3。

　　2.4 測序結果

　　16s rRNA基因序列進行了BLAST分析，均為鏈球菌，其中無乳鏈球菌11株，乳房鏈球菌1株，序列提交GenBank，登錄號見表4。

　　2.5 藥敏試驗結果

　　分離菌對卡那霉素、慶大霉素、氨芐西林和多黏菌素B等藥物有一定的耐藥性，對其他幾種藥物敏感(表5)，判定標準見表6。

　　3 討論

　　3.1 奶牛乳房炎病原菌

　　試驗分離得到的12株鏈球菌菌株，其中無乳鏈球菌11株，乳房鏈球菌1株，說明該地區的奶牛乳房炎病例中無乳鏈球菌較多。乳房炎病例中，金黃色葡萄球菌是最多的病原菌[10]，鏈球菌分離率僅次于金黃色葡萄球菌，鏈球菌性乳房炎引起的臨床癥狀不明顯，不易被察覺，但造成的危害極大，使奶牛乳產量明顯下降，品質變差，它們不僅感染乳房腺體，也會對奶牛乳腺組織造成不可逆的損傷與破壞，導致乳腺泌乳功能受損甚至完全喪失[11]。無乳鏈球菌專性寄生于奶牛乳腺、乳頭和生殖道，可引起嬰幼兒的敗血癥、腦膜炎、肺炎[12]，對青霉素、氯霉素、慶大霉素、紅霉素等較為敏感。根據本試驗得到的結果可以看出，受試藥物中有部分藥物，如紅霉素在奶牛的使用上還有一定的空間。氯霉素在獸醫上已經是禁用藥物，對慶大霉素有一定的抗藥性，分離菌對阿莫西林、萬古霉素和阿奇霉素等藥物敏感，可用于臨床上的感染控制。

　　3.2 奶牛乳房炎的防治

　　雖然抗生素能有效治療奶牛乳房炎，但藥物殘留危害人類健康，同時又產生耐藥性，因此不能依賴抗生素。近年來，中草藥治療乳房炎的研究越來越多，中草藥通過提高非特異性免疫和抗菌作用實現對奶牛乳房炎的治療[13-15]。奶牛乳房炎發生時很多是隱形感染的，擠奶時交叉感染會造成大規模乳房炎，奶牛場本身的管理因素，通風不良、衛生問題等也為病原菌傳播提供了一定條件，因此，及時對奶牛進行體檢、保證奶牛場環境也非常重要。