摘要：大豆RLPK2基因(GenBank登錄號：AY687391)是一個編碼N末端富含亮氨酸重復序列的類受體蛋白激酶基因。為分析大豆RLPK2基因的功能，該研究以野生型擬南芥和大豆RLPK2基因過表達擬南芥植株為材料，通過農桿菌介導法轉化野生型擬南芥，構建了大豆RLPK2基因過表達載體，分析了葉片衰老過程中葉綠素熒光參數、抗氧化酶活性及衰老相關基因表達量的變化。結果表明：(1)無論是野生型還是轉基因擬南芥，隨著葉片衰老進程的進行，光系統Ⅱ(PSⅡ)的最大光化學效率(Fv/Fm)、PSⅡ實際光化學效率(ΦPSⅡ)、光化學淬滅系數(qP)和光合電子傳遞速率(ETR)均呈下降趨勢，但后者下降趨勢更明顯;(2)激發壓(1qP)在葉片衰老前期的變化較為平穩，后期則急劇增加，且轉基因型比野生型擬南芥增加更明顯;(3)在葉片衰老的各個時期，轉基因擬南芥葉片丙二醛(MDA)含量均顯著高于野生型，而超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性均顯著低于野生型;(4)實時熒光定量PCR檢測結果表明，RLPK2轉基因擬南芥中衰老標志基因ATSAG12，衰老關鍵轉錄因子ATNAP、ATWRKY6和葉綠素降解關鍵酶編碼基因ATACD1表達量顯著上調。綜上認為，大豆類受體蛋白激酶基因RLPK2參與調控植物葉片衰老進程，其表達對葉片衰老具有促進作用。

　　關鍵詞：大豆RLPK2基因，葉片衰老，激發壓，抗氧化酶，丙二醛

　　作為進行光合作用的主要器官，葉片的生長發育優劣直接影響作物的生長、產量及品質。葉片衰老是葉片生長發育進程中的最終階段，它不是葉片細胞的簡單死亡過程，而是一種主動的、受細胞內部遺傳程序控制的、器官水平上動態的細胞程序性死亡過程，并且受到外部多種環境因素(光照、水分、溫度、礦質元素和微生物)及內部發育信號(激素、遺傳和基因調控)的協調控制(初夢圓和于延沖，2019)。此外，葉片衰老還與Ca2+、糖、活性氧(relativeoxygenspecies，ROS)水平和內源激素的變化等因素密切相關(張藝函等，2019)。葉片衰老主要表現為光合同化能力下降，細胞結構的退化，光合色素包括葉綠素和類胡蘿卜素的降解，蛋白質和核酸降解，ROS與丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量增加，水解酶及生長抑制因子持續增長等，這些特征在多種植物中已有描述(Wooetal.，2013;Wangetal.，2016)。葉片衰老能夠增強植物對生存環境的適應性，從而有利于其生存和延續。但對農作物的生長而言，植物過早衰老引起的葉片同化功能的減退也極大地影響和限制了農作物產量潛力的發揮，導致作物品質及產量的損失。因此，對葉片衰老機理的研究不僅在揭示植物的生態適應等方面具有一定意義，還在糧食生產上抑制早衰具有重要意義。大豆在我國播種面積僅次于玉米、水稻、小麥和馬鈴薯，是第五大糧食作物，其含有豐富的植物蛋白質，同時又可用來榨油，因此是我國重要的油料作物。相關研究表明，葉片早衰嚴重影響著大豆正常的生長發育，并會引起產量及品質的下降(呂林濤，2018)。鑒定大豆葉片衰老相關基因及其功能對于提高大豆的優質高產和育種改良具有重要的科學意義和深遠的應用價值。

　　植物類受體蛋白激酶(receptorlikeproteinkinase，RLKs)具有特殊的蛋白質結構，在植物中普遍存在，占植物蛋白激酶總量的60%，是植物中較大的基因家族之一，參與細胞信號轉導途徑過程，并在植物的生長發育和環境的適應過程中具有重要作用(Shiu&Bleecker，2001)。其中，富含亮氨酸重復序列(leucinerichrepeat，LRRs)型類受體蛋白激酶是RLKs中最大的一個亞家族(Coletteetal.，2011)。迄今為止，LRRsRLKs蛋白的結構特點和表達模式在擬南芥(阿依江·哈拜克等，2014)、煙草(曾建斌，2011)、花生(莊瑞蓉等，2018)、馬鈴薯(謝潔等，2019)等植物中均有研究。相關研究表明，LRRRLKs在植物整個生長發育過程中具有重要作用(Diévart&Clark，2004)。謝潔等(2019)發現馬鈴薯LRR類受體蛋白激酶SCLRRK1在低溫條件下表達受到抑制，證實其參與低溫脅迫響應過程。Zhou等(2016)發現LRRRLKs型基因調節擬南芥花藥的發育過程。作為LRRRLKs家族中被研究較為廣泛的一員，BAK1在油菜素內酯(BR)信號轉導途徑(Heetal.，2007)、植物先天免疫反應(韋莉等，2019)、細胞死亡調控(Zhouetal.，2019)等方面發揮作用。大豆RLPK2基因(GenBank登錄號：AY687391)是植物分子遺傳學研究組李小平副教授前期以大豆科豐34為材料篩選到的一個編碼N末端富含亮氨酸重復序列的類受體蛋白激酶基因，前期研究結果發現人工誘導衰老處理顯著提高了該基因在大豆初生葉片中的轉錄水平，初步分析顯示該基因可能參與大豆葉片衰老的調控過程。本研究在此基礎上構建了大豆RLPK2基因過表達載體并轉化野生型擬南芥，對轉基因擬南芥葉片衰老進程進行分析，進一步揭示該基因在植物葉片衰老中的功能，以期為延緩葉片衰老從而提高大豆作物產量和改善作物品質提供理論依據。

　　1材料與方法

　　1.1材料及培養方法

　　本試驗所使用的擬南芥(Arabidopsisthaliana)為哥倫比亞野生型(WT)擬南芥(Columbia0)。培養環境條件如下：溫度為20～25℃，光暗周期為16h光照/8h黑暗，光照強度為100SymbolmA@

　　mol·m2·s1，相對濕度為80%。

　　1.2總RNA的提取和反轉錄

　　采用QIAGEN的植物RNA提取試劑盒RNeasyPlantMiniKit按照操作說明提取大豆品種科豐34葉片總RNA，經微量紫外分光光度計(Merinton，美國)檢測其純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后，利用Thermo公司提供的cDNA試劑盒按照反轉錄說明書合成cDNA第一條鏈。

　　1.3RLPK2全長cDNA引物設計及RTPCR基因擴增

　　利用PrimerPremier5.0軟件設計RLPK2基因的特異性引物，根據Gateway技術構建表達載體的要求，在引物5′端加上AAAAAGCAGGCTCG，引物序列如下：

　　RLPK2OXF：5′AAAAAGCAGGCTCGATGAGA

　　TCAGTAAGTTCCCCTG3′;

　　RLPK2OXR：5′AGAAAGCTGGGTTTTAATCT

　　CTCTTCTCCAAGTAAGAAG3′。

　　采用高保真PhusionDNA聚合酶進行PCR擴增。反應程序：94℃預變性30s，35個循環(94℃30s，62℃30s，72℃30s)，循環結束后72℃10min延伸反應，4℃保溫。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，回收特異性目標條帶，送樣測序，選取測序正確的克隆進行后期載體的構建。

　　1.4RLPK2過表達載體構建、擬南芥遺傳轉化及純合體篩選

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