摘要：【目的】苦瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌苦瓜?；?Fusarium oxysporum f.sp.momodicae)侵染引起的一種重要土傳病害。為有效防控該病害，對其病原菌進行綠色熒光蛋白基兇(gfp)標記，為研究病原菌在苦瓜植株體內的侵染特性提供可視化跟蹤檢測手段?！痉椒ā坎捎棉r桿菌介導的遺傳轉化方法對苦瓜枯萎病原菌強致病性野生型菌株FJAT-3018進行綠色熒光蛋白基兇(gfp)標記，通過對轉化子的菌落形態觀察、生長速率和致病性測定，篩選出遺傳穩定的轉化子。【結果】野生型菌株FJAT-3018的轉化效率約為14.5個轉化子/106個孢子。經10次繼代培養，篩選獲得的轉化子在菌落形態、生長速率和致病性方面與野生型菌株FJAT-3018無明顯差異，gfp基兇在轉化子的菌絲體和分生孢子中均能強表達;通過激光共聚焦顯微鏡掃描跟蹤發現，轉化子能夠在苦瓜植株根部和莖部侵染與定殖?！窘Y論】綠色熒光蛋白基因已成功轉入到苦瓜野生型菌株FJAT-3018中，其轉化子具有良好的遺傳穩定性且致病力不受影響。

　　關鍵詞：苦瓜;枯萎病;綠色熒光蛋白;基因標記

　　0引言

　　【研究意義】苦瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌苦瓜?；?Fusarium oxysporum f.sp.Momodicae)侵染引起的一種毀滅性土傳病害，該病害在苦瓜整個生育期均可發生，并導致植株萎蔫死亡，造成產量損失，嚴重制約了苦瓜產業的發展[1-2]。為有效防控該病害，亟需了解該病原菌對苦瓜的侵染特性。因此，建立一種可視化的跟蹤標記手段，有助于深入研究該病原菌的侵染過程和指導該病害防控?！厩叭搜芯窟M展】綠色熒光蛋白標記基因(gfp)可為研究病原菌在植株體內的侵染蔓延提供可視化跟蹤技術[3]。它具有熒光性質穩定、直觀、操作方便和不需要添加外源底物就可以在活細胞中直接檢測等優點，已被廣泛應用于真菌分子生物學研究[4-5]。適用于鐮刀菌屬真菌的gfp基因轉化方法有多種，如PEG介導法、農桿菌介導法和基因槍介導法等[6-8]。其中農桿菌介導的轉化方法是直接以真菌孢子或菌絲為受體，較PEG介導法和基因槍介導法的操作更簡單，可減少轉化過程中其他因素的影響，且轉化效率和遺傳穩定性也更高[9]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，國內外學者已利用gfp基因成功標記了番茄、香蕉、甜瓜和玉米等寄主作物尖孢鐮刀菌[10-14]，但未見苦瓜枯萎病原菌的gfp基因標記的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】為有效防控該病害，采用農桿菌介導的遺傳轉化方法對苦瓜枯萎病原菌強致病性野生型菌株FJAT-3018進行綠色熒光蛋白基因(gfp)標記，并比較轉化前后菌株的菌落形態、生長速率和致病性差異，篩選m遺傳穩定標記的轉化子，有助于通過可視化跟蹤觀察深入研究該病原菌的侵染過程和指導該病害防控。

　　1材料與方法

　　1.1試驗材料

　　苦瓜枯萎病原菌強致病菌株FJAT-3018屬于尖孢鐮刀菌苦瓜?；?Fusarium oxysporum f.sp.Momodicae)，由本研究室保存;供試苦瓜感病品種(新翠)植株購自廈門如意種苗高科技股份有限公司;農桿菌AGL-1菌株由中國農業大學惠贈，載體pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp由福建省農業科學院作物研究所提供;潮霉素B、卡那霉素、特美汀等抗生素均購白美國Sigma公司;PDB培養基(200g馬鈴薯，15g葡萄糖，加水定容至1000 mL);PDA固體培養基(200g馬鈴薯，15g葡萄糖，15g瓊脂粉，加水定容至1000mL)，篩選培養基(含終濃度為100μg·mL-1潮霉素B和200μg·mL-1特美汀的PDA固體培養基);農桿菌介導轉化所需的試劑及3種培養基配方(基礎培養基、誘導培養基和共培養培養基)參考文獻[15]，具體配方見表1?；旌侠w維微孔濾膜(購白上海生工).0.22μm微孔過濾器(Millipore)。

　　1.2苦瓜枯萎病菌的綠色熒光蛋白基因轉化

　　采用農桿菌介導法進行苦瓜枯萎病菌的gfp基因轉化，轉化方法參照文獻[15]，略做改動。具體步驟如下：(1)苦瓜枯萎病原菌菌株FJAT-3018于含200μg·mL-1硫酸鏈霉素的PDA固體培養基純化培養7d，在培養皿中加入適量無菌水，用無菌涂布棒刮洗菌落表面洗出分生孢子，孢子懸浮液用雙層無菌擦鏡紙過濾，并用誘導培養基調整分生孢子濃度為1×106個·mL-1備用。(2)將已轉入pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp載體的農桿菌AGL-1用基礎培養基(MM培養基)于28℃、250r·min-1搖床培養48h，后用誘導培養基(IM培養基)調整菌液濃度為OD600=0.15，繼續搖床培養約6h至菌液OD600約為0.60。(3)將滅菌的混合纖維微孔濾膜放置在共培養培養基(CM培養基)上，并取已制備好的FJAT-3018孢子懸浮液和農桿菌液各100μL混勻后于混合纖維微孔濾膜上均勻涂布，10個重復，并于25℃暗培養48h。(4)共培養48h后，將混合纖維微孔濾膜用無菌刀片劃成小塊分散擺放到篩選培養基(含終濃度為150μg·mL-1潮霉素B和200μg·mL-1特美汀的PDA培養基)上，于28℃暗培養72h。(5)篩選培養基平板放置在BD-BGC1藍光切膠儀中，挑取發出明亮綠色熒光菌落邊緣的菌絲體于篩選培養基上復篩，繼續用藍光切膠儀挑選出發出明亮綠色熒光的平板，并通過單孢分離法獲得相對應轉化子。

　　1.3轉化子的遺傳穩定性檢測

　　單孢分離純化獲得的強綠色熒光表達的不同轉化子在PDA培養基上，28℃培養6d后，選取菌落邊緣菌絲轉接到新的PDA培養基上繼續培養，重復以上方法連續培養10代，觀察各轉化子的菌落形態變化，測量菌落生長速度，以野生型菌株FJAT-3018為對照。挑取熒光強且遺傳穩定的轉化子于-80℃甘油冷凍保存，同時挑取代表性轉化子的菌絲體制成玻片，置于熒光顯微鏡下觀察菌絲和孢子的熒光強度。

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