摘 要：GLK轉(zhuǎn)錄因子隸屬于GARP家族，廣泛存在于高等植物中，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子能夠起到促進葉綠體發(fā)育的調(diào)控機制，水稻中有一對GLK基因，分別為OsGLK1與OsGLK2。為深入探究該基因的功能，本文克隆了水稻中OsGLK2的啟動子序列，并對水稻GLK基因的表達進行分析。在OsGLK2啟動子上發(fā)現(xiàn)了8個TATA-box，13個CAAT-box，5個G-box位點;不同水稻種質(zhì)上OsGLK2基因啟動子存在很大多態(tài)性，OsGLK1及OsGLK2主要在葉子及根中表達，不同種質(zhì)間的表達差異明顯，3個基因型的表達量明顯低于及其他樣;分析發(fā)現(xiàn)CAAT-box是影響OsGLK2表達量的調(diào)控位點。

　　關(guān)鍵詞：水稻(Oryza sativa);GLK轉(zhuǎn)錄因子;啟動子;多態(tài)性;表達模式

　　水稻科學(xué)(英文版)主要刊登以水稻為研究對象的未經(jīng)發(fā)表的英文原始論文、綜述、研究簡報、學(xué)術(shù)活動簡訊等，內(nèi)容涉及水稻研究的各個領(lǐng)域。

　　GLK轉(zhuǎn)錄因子屬于GARP家族，普遍存在于高等植物中，能夠調(diào)控葉綠體的發(fā)育[1]。在擬南芥上，雙突變體 AtGLK1和 AtGLK2 在所有光合組織中呈淡綠色，呈現(xiàn)減少 Granal 類囊體葉綠體特征[1] ;而過表達 AtGLK1和 AtGLK2 使淡綠色表型更加突出[2]。ZmGLK1 同源到 Golden2 (G2)上，并且玉米 g2 突變體葉片顯淡綠色[3]。 從小立宛蘚(Physcomitrella patens)中分離 GLK 基因，表明它們規(guī)管在葉綠體發(fā)育中。因此，GLK 轉(zhuǎn)錄因子在植物上具有調(diào)節(jié)葉綠體發(fā)育的功能。

　　前人研究表明，水稻中有一對GLK基因，分別為OsGLK1與OsGLK2。OsGLK1 能直系同源到玉米 Golden2 - 1 (ZmGLK1) 基因[4]。插入突變體證明OsGLK1 和 OsGLK2 的作用可能類似，反映了一定程度的功能冗余[4]。含 OsGLK2-FOX 序列D 愈傷組織在 N6D 培養(yǎng)基上顯示綠色，OsGLK2野生型愈傷組織再生過程中表現(xiàn)出相似的表達模式[5]。本文對OsGLK2的啟動子進行克隆和序列分析，同時利用實驗室的豐富水稻種質(zhì)資源，分析該基因在不同種質(zhì)中的表達模式，旨在為深入認識GLK基因在水稻上的進化模式及在不同種質(zhì)中的表達特性提供新信息。

　　1 材料與方法

　　1.1 植物材料

　　本實驗所用水稻材料來源于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室，包括50份水稻突變體(L124-L173，表1)及對照中花11(ZH11)，采集開花后10天的葉、根、花以及成熟種子，液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.2 DNA提取

　　液氮將植物組織組織研磨成細粉，加入65℃預(yù)熱的2×CTAB抽提液1000μL和β-巰基乙醇4 μL，混勻，65℃溫育1.5 h，間斷混勻。12000 rpm離心10 min，轉(zhuǎn)移上清，加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)(v/v)，抽提上清，顛倒混勻7 min，12000 rmp離心10 min。轉(zhuǎn)移上清，再用等體積的氯仿/異戊醇(24：1)(v/v)抽提上清液，12000 rpm離心10 min，轉(zhuǎn)移上清。上清加入等體積的異丙醇，-20℃冰浴1 h。12000 rpm離心10 min，棄上清。75%酒精洗滌2次，用ddH2O溶解DNA。用Thermo 超微量核酸檢測儀檢測 DNA 濃度與質(zhì)量。

　　1.3 RNA提取

　　根據(jù)實驗需取擬南芥一定部位材料0.1 g左右，液氮中研磨，加入500 μL RNAiso Plus(Takara)試劑分離RNA，震蕩均勻，室溫放置10 min。加入200 μL氯仿，震蕩，后靜置3 min 12000 g，4℃離心15 min。取無色水相層置入新的1.5 mL離心管中，加入與其體積相同的異丙醇，-20℃下靜置1 h，然后12000 g、4℃離心10 min。用75%乙醇洗滌兩次后晾干，用RNase-free水進行溶解，用Thermo 超微量核酸檢測儀檢測DNA 濃度與質(zhì)量。

　　1.4 RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA

　　RNA反轉(zhuǎn)錄首先用DNAase去除RNA中的雜質(zhì)DNA，后用Takara公司的5*PrimeScript RT Master Mix進行反轉(zhuǎn)錄，體系如下：5*PrimeScript RT Master Mix 2 μL，RNA 500 ng，添加ddH2O至10 μL。然后將混合液放入PCR儀，進行如下條件的反應(yīng)：37℃ 15 min，85℃ 5 s。反應(yīng)完成后將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA儲存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

　　1.6 基因表達的qRT-PCR分析

　　本實驗采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)對基因表達量進行檢驗，儀器型號Bio-RAD CFX96。采用如下體系：cDNA 1 mg/μL，qRT-FP 5 μL，qRT-RP 0.5 μL，TransStart Top Green qRT-PCR SuperMix(全式金公司)7.5 μL，加dd H2O至15 μL。該實驗使用引物為GLK2-qRT-F：AGAGCATAGACGCAGCCATC，GLK2-qRT-R：TGCTTGTGCAGCTCAGACAT。qRT-PCR過程為：首先95℃預(yù)變性30 s，接著95℃變形30 s，56℃退火10 s，40個循環(huán)。實驗完成后，得到Ct值，計算相對表達量。

　　1.7 OsGLK2啟動子的克隆

　　擴增PCR反應(yīng)體系為50 μL：TaKaRaprimSTAR(2×)25 μL，ddH2O 21 μL，模版 基因組DNA 2 μL，上下游引物(10 μM)各1 μL;擴增程序為98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min 30 s，37個循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測擴增產(chǎn)物，用 SanPrep 柱式DNA膠回收試劑盒(生工，上海)對獲得的特異性擴增片段進行回收。該實驗使用引物為GLK2-Promoter-F：AAGCTTGCTCCACGCTTTCCAAGTTCCT，GLK2-Promoter-R：GGATCCCCCAAAATCTCTCCCCTCTACA。

　　對片段進行回收、克隆，反應(yīng)體系：在微型離心管中依次加入PCR 產(chǎn)物 0.5～4 μL(根據(jù)PCR 產(chǎn)物量可適當增減，最多不超過4 μL)，pEASY- T3 Cloning Vector 1 μL輕輕混合，室溫 (20 ℃-37 ℃) 反應(yīng)5 分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上。

　　轉(zhuǎn)化過程：加連接產(chǎn)物于50 μL Trans1-T1感受態(tài)細胞中(在感受態(tài)細胞剛剛解凍時加入連接產(chǎn)物)，輕彈混勻，冰浴20～30 min。42℃熱激30 s，立即置于冰上2 min。加250 μL平衡至室溫的SOC/LB，200轉(zhuǎn)、37℃孵育1 h。 取8 μL 500 mM IPTG，40 μL 20 mg/mL X-gal混合，均勻地涂于準備好的平板(AIX培養(yǎng)基)上，在37℃ 放置30 min。待IPTG，X-gal 被吸收后，取200 μL 菌液鋪板，培養(yǎng)過夜。

　　用SanPrep 柱式質(zhì)粒 DNA 小量抽提試劑盒(生工公司)提取質(zhì)粒，酶切鑒定后選取合適的質(zhì)粒送測序公司測序，測序引物用T7和SP6。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 OsGLK2啟動子克隆

　　通過合適的PCR體系擴增得到了OsGLK2啟動子片段，所擴增片段大小在2000 bp 左右，符合目的片段大小。雖然電泳結(jié)果呈現(xiàn)輕微雜帶，但是經(jīng)過對目的片段的切膠回收后，能夠保證目的片段的純度。取得該片段后，用目的片段連接測序載體p-Easy T3，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，送到測序公司測序。

　　A.ZH11的OsGLK2啟動子PCR擴增結(jié)果;B.L124-L127的OsGLK2啟動子PCR擴增結(jié)果

　　圖1 OsGLK2啟動子部分PCR擴增結(jié)果

　　Fig.1 OsGLK2 promoter partial PCR amplification results

　　2.2 OsGLK2啟動子序列分析

　　為了探究啟動子序列對于OsGLK2基因表達的影響，對中花11(對照)中OsGLK2基因啟動子元件進行分析(圖1)。結(jié)果顯示，以主要的啟動子元件為例(表1)，OsGLK2上具有8個TATA-box，13個CAAT-box，5個G-box。以上調(diào)控元件主要功能是：TATA-box，核心啟動子;CAAT-box，增強子;G-box，光響應(yīng)的順勢調(diào)控元件。

　　2.3 OsGLK2啟動子在不同種質(zhì)中的多態(tài)性

　　以ZH11為參照，通過測序后的序列比對發(fā)現(xiàn)，50組水稻種質(zhì)樣品均準確地克隆到了目的片段，即OsGLK2的啟動子。我們還分析了50份水稻種質(zhì)資源在OsGLK2啟動子區(qū)的多態(tài)性位點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表1)，許多種質(zhì)在該區(qū)段部分都出現(xiàn)了堿基的突變，其中L132、L149及L160由于第1860位點的堿基發(fā)生突變(A/T)，造成了該位置CAAT-box被破壞;另外，L133的1265堿基發(fā)生突變(T/G)，造成該位置受到破壞。

　　2.4 OsGLK1及OsGLK2的表達分析

　　以ZH11為材料，取花、葉片(花后10 d)、根(花后10 d)及成熟種子，分析兩個GLK基因的表達模式)，結(jié)果顯示(圖2 A)，OsGLK1及OsGLK2主要在葉子及根中表達，花中少量表達，成熟種子中極少表達;不同種質(zhì)間分析表明(圖2 B)，L132、L149及L160的基因表達量明顯低于對照ZH11及其他樣品，而其他樣品間差異不明顯。