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基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討舒眠膠囊治療失眠的作用機(jī)制

來源:期刊VIP網(wǎng)所屬分類:綜合論文時(shí)間:瀏覽:

  摘要 目的:通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探究舒眠膠囊治療失眠的作用機(jī)制。方法:以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為基礎(chǔ),對舒眠膠囊、失眠相關(guān)作用靶點(diǎn)進(jìn)行篩選,應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP)和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測舒眠膠囊靶點(diǎn),應(yīng)用GeneCards等5個(gè)數(shù)據(jù)庫收集失眠相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù);運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫、DAVID數(shù)據(jù)庫、Cytoscape 3.5.1軟件對藥物和疾病的交集基因進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)、京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集分析,并構(gòu)建“有效成分-靶點(diǎn)-疾病”圖,分析舒眠膠囊治療失眠的作用機(jī)制;最終,利用Discovery Studio軟件進(jìn)行分子對接模擬驗(yàn)證。結(jié)果:舒眠膠囊通過35個(gè)活性成分作用于120個(gè)失眠相關(guān)靶點(diǎn)。主要通過槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、燈心草菲類衍生物8個(gè)主要活性成分,作用于PIK3R1、TNF、CXCL8、AKT1、IL6等14個(gè)核心靶點(diǎn),通過調(diào)控Toll樣受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路起治療失眠作用。分子對接結(jié)果顯示關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)對接良好。結(jié)論:舒眠膠囊通過多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮抗炎作用,從而改善失眠。

  關(guān)鍵詞 舒眠膠囊;酸棗仁;失眠;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對接;中成藥;作用機(jī)制;炎癥

  失眠是以睡眠時(shí)長或深度不足為主癥,患者自覺影響到白天功能及活動(dòng)的一種主觀感覺[1]。國際睡眠障礙分類第三版明確指出,慢性失眠在人群中的患病率為9% ~12%,中國睡眠研究會(huì)2017年發(fā)布的報(bào)告顯示,我國失眠的患病率達(dá)38%,遠(yuǎn)高于世界平均水平[2]。失眠發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,是心血管疾病、慢性疼痛綜合征、抑郁、焦慮、糖尿病、肥胖和哮喘等疾病的危險(xiǎn)因素之一[3]。當(dāng)前對于失眠的治療仍以藥物干預(yù)為主,代表性藥物為苯二氮 艸 卓 類藥物,這類藥物起效速度快,對失眠癥改善明顯,然而,長期使用該藥物存在精神錯(cuò)亂、認(rèn)知障礙、藥物成癮性和戒斷反應(yīng)等不良反應(yīng)[4]。舒眠膠囊是一種中成藥,由酸棗仁、柴胡、白芍、合歡皮、合歡花、僵蠶、蟬蛻和燈心草8味中藥組成,因其較好的臨床療效和良好的依從性而被廣泛應(yīng)用于臨床[5]。因此,探究舒眠膠囊治療失眠的作用機(jī)制具有重要意義。

  網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于人工智能和大數(shù)據(jù)背景,運(yùn)用數(shù)據(jù)庫搜索、計(jì)算機(jī)模擬等技術(shù),整合已知的臨床、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),預(yù)測藥物治療疾病的成分、靶點(diǎn)和通路,揭示三者的相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò),適用于中草藥復(fù)雜作用機(jī)制的初步探究[6]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法解釋舒眠膠囊和失眠的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,預(yù)測舒眠膠囊治療失眠的調(diào)控機(jī)制,利用分子對接技術(shù)驗(yàn)證預(yù)測。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探究舒肝解郁膠囊治療失眠作用機(jī)制流程見圖1。

  1資料與方法

  1.1舒眠膠囊化合物、作用靶點(diǎn)檢索

  通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)(https://tcmspw.com)檢索并篩選舒眠膠囊8味中藥的有效成分和作用靶點(diǎn),篩選條件為口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18,采用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)檢索等方法進(jìn)行補(bǔ)充檢索,基于Unitprot數(shù)據(jù)庫(https://www.Unitprot.org/)將靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)化為對應(yīng)基因名。結(jié)合文獻(xiàn)納入原兒茶酸、兒茶醛、霉酚酸內(nèi)酯等經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道的藥物化合物[7-8]。

  1.2疾病靶點(diǎn)預(yù)測

  以“Insomnia”為關(guān)鍵詞,檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)(https://omim.org/)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://www.pharmgkb.org/)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)、中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)(Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine,TCMIP)(http://www.tcmip.cn)查找失眠的相關(guān)靶點(diǎn),去重后在Uniprot中轉(zhuǎn)化為對應(yīng)基因名。

  1.3交集靶點(diǎn)的篩選

  在微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)在線平臺(tái)上分別錄入1.1項(xiàng)下舒眠膠囊預(yù)測靶點(diǎn)和1.2項(xiàng)下失眠相關(guān)靶點(diǎn),繪制韋恩圖。

  1.4蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

  基于STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)獲取1.3項(xiàng)下靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction,PPI),設(shè)置物種為人(homo sapines),最高置信度>0.9,并利用Cytoscape 3.5.1軟件分析PPI網(wǎng)絡(luò),用拓?fù)浞椒ㄔu(píng)估核心網(wǎng)絡(luò),以“節(jié)度值(Degree DC)大于2倍中位數(shù)”為篩選條件,滿足篩選條件的靶點(diǎn)為舒眠膠囊發(fā)揮作用的核心靶點(diǎn)蛋白。

  1.5基因本體富集分析和京都基因和基因組百科全書富集分析

  對核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析,分析平臺(tái)為DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/),分析結(jié)果以氣泡圖形式呈現(xiàn),探究舒眠膠囊治療失眠可能的作用機(jī)制。

  1.6“有效成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

  基于Cytoscape 3.5.1軟件,構(gòu)建舒眠膠囊中藥組成、有效成分與作用靶點(diǎn)間相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖,結(jié)合失眠相關(guān)靶點(diǎn),形成舒眠膠囊與失眠相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖,對后者所形成的“有效成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析評(píng)估,設(shè)置“節(jié)度值(Degree DC)>2倍中位數(shù)”,篩選舒眠膠囊治療失眠癥的主要活性成分。

  1.7核心靶點(diǎn)的分子對接模擬驗(yàn)證

  利用Discovery Studio軟件,對1.4項(xiàng)下篩選出的核心靶點(diǎn)和1.6項(xiàng)下篩選出的關(guān)鍵活性成分進(jìn)行分子對接模擬驗(yàn)證,二者的結(jié)構(gòu)信息分別來源于RCSBPDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)和Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)。

  2結(jié)果

  2.1舒眠膠囊有效成分篩選

  共收集到41個(gè)有效成分,297個(gè)藥物靶點(diǎn)。見表1。875E204C-D465-43B7-946D-FEFA86E0F319

  2.2疾病靶點(diǎn)采集

  共得到失眠癥相關(guān)基因1 295個(gè)。

  2.3“藥物-有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建

  舒眠膠囊藥物-有效成分-靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)包括346個(gè)節(jié)點(diǎn),988條相互關(guān)系。圖中的紅色圓形、綠色菱形、藍(lán)色三邊形分別代表舒眠膠囊的8味中藥,41個(gè)有效成分和297個(gè)藥物靶點(diǎn)。見圖2。

  2.4交集靶點(diǎn)篩選

  舒眠膠囊藥物靶點(diǎn)297個(gè)和失眠相關(guān)靶點(diǎn)1 295個(gè),取交集獲得120個(gè)交集靶點(diǎn)。見圖3。

  2.5PPI關(guān)系網(wǎng)絡(luò)分析

  來自STRING平臺(tái)(120個(gè)節(jié)點(diǎn),380條邊),PPI enrichment p-value:<1.0e-16,average node degree:6.33,avg.local clustering coefficient:0.542。來自Cytoscape 3.5.1(105個(gè)節(jié)點(diǎn)、380條邊),節(jié)點(diǎn)越大,顏色越深,則Degree值越高。見圖4。

  獲得14位靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)。Degree值排名前6位的靶點(diǎn)為APP、PIK3R1、TNF、CXCL8、AKT1、IL6,因APP靶點(diǎn)與失眠疾病的相關(guān)性過低,選取后5位靶點(diǎn)作為舒眠膠囊治療失眠的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接。見表2。

  2.6GO富集分析及KEGG通路富集分析

  結(jié)果顯示,涉及的生物過程主要包括RNA轉(zhuǎn)錄、炎癥反應(yīng)、脂多糖介導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)等。見圖5。

  前10位通路的 P 值(富集顯著性)均小于0.05,表示分析可信度高。其中,Toll樣受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(Phosphatidylinositol-3-kinase-protein Kinase B,PI3K/AKT)信號(hào)通路與失眠發(fā)生機(jī)制密切相關(guān),且3條通路均為炎癥相關(guān)通路。PIK3R1、TNF、CXCL8、AKT1、IL6均出現(xiàn)在Toll樣受體信號(hào)通路,APP未富集在前10位通路中。見圖6。

  2.7“舒眠膠囊有效成分-失眠-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建及分析

  舒眠膠囊與失眠PPI網(wǎng)絡(luò)涉及8味中藥,35個(gè)活性成分,120個(gè)交集靶點(diǎn)和1個(gè)疾病,分別用紅色圓形、綠色菱形、藍(lán)色三角形和黃色正方形表示。見圖7。獲得的18個(gè)活性成分可能是舒眠膠囊治療失眠的主要活性成分,選取Degree值前8位的主要活性成分作為舒眠膠囊的關(guān)鍵活性成分進(jìn)行分子對接。見表3。

  2.8分子對接模擬驗(yàn)證

  所有對接的最低結(jié)合能結(jié)果均小于0,說明配體與受體均可自發(fā)結(jié)合,其中PIK3R1蛋白與9個(gè)小分子結(jié)合的最低結(jié)合能均小于-5 kJ/mol,結(jié)合效果整體要優(yōu)于其他4種,而CXCL8蛋白結(jié)合效果較差。A3(山柰酚)、DXC4(燈心草菲類衍生物)與5位靶點(diǎn)基因的結(jié)合能均小于陽性藥物,A4(槲皮素)、DXC2(木犀草素)、DXC11與4位靶點(diǎn)基因的結(jié)合能均小于陽性藥物,A4、A3、DXC2、DXC11及DXC4可能是舒眠膠囊治療失眠的關(guān)鍵成分。見圖8。

  PIK3R1與DXC4在Val851形成氫鍵,且作用距離為3.18 ;TNF與A3在Tyr151形成氫鍵,且作用距離為2.67 ;CXCL8與DXC5無氫鍵作用,這可能是結(jié)合力不高的原因;AKT1與A4在Ala123、Glu234和Asp292形成氫鍵,且作用距離為3.01 、2.66 和2.70 ;IL6與A4在Glu672、Met704和Asp784形成4個(gè)氫鍵,且作用距離為3.01 、2.64 、2.97 和2.98 ;PIK3R1與Zolpidem在Gln859形成氫鍵,且作用距離為3.22 。見圖9~14(A:小分子-蛋白對接,B、C:小分子與蛋白對接細(xì)節(jié))。

  3討論

  舒眠膠囊治療失眠療效確切,多項(xiàng)隨機(jī)對照試驗(yàn)結(jié)果顯示,舒眠膠囊對比陽性藥物,在失眠治療中有效率更高[9]。中醫(yī)將失眠稱為不寐,多因肝郁化火傷陰,動(dòng)搖心神,神不安而不寐。本方可用于肝郁傷神所致的失眠癥,其中酸棗仁和柴胡以其寧心安神、疏肝解郁的功效共為君藥;白芍、合歡皮、合歡花3藥為臣,養(yǎng)血柔肝、解郁安神;僵蠶歸肝、肺、胃經(jīng),息風(fēng)止痙、化痰散結(jié),蟬蛻歸肺、肝經(jīng),散風(fēng)除熱、疏肝解痙,二藥共調(diào)肝臟,祛痰熄風(fēng),為佐藥;燈心草性寒,既可清心火,又可利小便以引導(dǎo)心火下降,為使藥。諸藥配合可達(dá)疏肝解郁、寧心安神之效。

  酸棗仁為養(yǎng)心安神之要藥,有效成分包括酸棗仁總皂苷、總黃酮、總生物堿等化合物,已被證實(shí)具有催眠、鎮(zhèn)靜作用。Yan等[10]酸棗仁水提物聯(lián)合戊巴比妥鈉喂給失眠模型小鼠,結(jié)果顯示,小鼠睡眠潛伏期顯著縮短,睡眠時(shí)間明顯增加,其催眠作用可能與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平增加、神經(jīng)遞質(zhì)合成中的氨基酸代謝改變相關(guān)。柴胡是傘形科植物柴胡的干燥根,具有疏肝解郁的功效,研究顯示,柴胡中的柴胡皂苷通過促進(jìn)腦脊液中5-羥色胺的分泌改善失眠[11]。2021年西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中,梁凡凡等[12]將舒眠膠囊分別喂給戊巴比妥鈉給藥小鼠和PCPA失眠大鼠,結(jié)果顯示,舒眠膠囊具有鎮(zhèn)靜、催眠的作用,其具體作用機(jī)制與提高腦組織伽馬氨基丁酸水平、降低葡萄糖水平、上調(diào)海馬5-羥色胺1a受體蛋白的表達(dá)相關(guān)。

  3.1舒眠膠囊富集分析

  根據(jù)GO富集與KEGG通路富集結(jié)果,舒眠膠囊通過多個(gè)途徑起治療作用。排除癌癥等通路后,結(jié)合失眠的發(fā)病過程與常見信號(hào)通路,舒眠膠囊可能通過以下3條炎癥介質(zhì)相關(guān)通路發(fā)揮作用。

  Toll樣受體(TLRs)信號(hào)通路是一個(gè)受體家族,參與病原體識(shí)別和宿主防御,其上游為內(nèi)源性(損傷相關(guān)分子模式,DAMPs)或外源性(病原體相關(guān)分子模式,PAMPs)配體[13]。TLRs中的TLR4通路已被證明可以觸發(fā)和調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥反應(yīng)[14]。研究表明,睡眠剝奪增強(qiáng)了TLR4和其下游MyD88的過表達(dá),MyD88通過觸發(fā)核因子κB和促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)的表達(dá),上調(diào)促炎癥基因的表達(dá)[15]。875E204C-D465-43B7-946D-FEFA86E0F319

  TNF是免疫系統(tǒng)重要的細(xì)胞因子,TNF信號(hào)通路的激活與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞成活、炎癥和免疫等生物過程相關(guān)[16]。當(dāng)TNF含量正常時(shí),TNF通過節(jié)律性表達(dá)調(diào)控睡眠覺醒節(jié)律,延遲非快速眼動(dòng)睡眠的覺醒時(shí)間,當(dāng)TNF含量過高時(shí),也發(fā)揮抑制正常睡眠的作用[17],因此推測TNF信號(hào)通路與睡眠關(guān)系密切。

  PI3K/AKT信號(hào)通路的下游基因?yàn)镮L-6、TNF等炎癥介質(zhì)基因,該信號(hào)通路的表達(dá)上調(diào)炎癥基因轉(zhuǎn)錄活性,促使血清中炎癥介質(zhì)增加[18]。研究表明,快速眼動(dòng)睡眠小鼠睡眠剝奪后可引起氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),剝奪睡眠7 d后,小鼠腦組織中的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活,下游PI3K/AKT/sk-3β的激活降低,炎癥介質(zhì)水平增加,抗炎因子、轉(zhuǎn)錄因子Nrf-2和抗氧化劑酶HO-1的水平降低[19]。還有研究表明,ApoM-S1P可通過與S1PR2結(jié)合激活PI3K/AKT通路,增加PI3K和AKT磷酸化,減輕TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)損傷和炎癥反應(yīng),阻止核因子κB的核轉(zhuǎn)運(yùn),降低凋亡相關(guān)蛋白、炎癥介質(zhì)和黏附分子的表達(dá)[20-21]。

  基于此,本研究推測舒眠膠囊可通過多個(gè)信號(hào)通路發(fā)揮治療失眠的功效,分子對接結(jié)果顯示,與關(guān)鍵有效成分對接良好的PIK3R1、TNF、AKT1、IL6均與炎癥通路相關(guān),Toll樣受體信號(hào)通路、TNF信號(hào)、PI3K/AKT通路可能是舒眠膠囊治療失眠的關(guān)鍵機(jī)制之一。

  3.2關(guān)鍵靶點(diǎn)的分析

  通過SPRING分析得到舒眠膠囊的核心靶點(diǎn)有14位,其中,PIK3R1、TNF、CXCL8、AKT1、IL6等涉及炎癥反應(yīng)相關(guān)的靶點(diǎn)節(jié)度值最高,分子對接結(jié)果表明這些靶點(diǎn)與關(guān)鍵活性成分有較好的結(jié)合力,說明舒眠膠囊可通過這些重要靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用。PIK3R1基因是PI3K調(diào)節(jié)亞基的編碼基因,PI3K是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,參與介導(dǎo)炎癥、應(yīng)激等細(xì)胞反應(yīng)[22]。蛋白激酶B AKT1調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞凋亡[23],參與調(diào)節(jié)代謝、增殖、生長和血管的生成等過程[24]。CXCL8基因表達(dá)IL-8,IL-8屬于細(xì)胞因子的一種,可影響炎癥刺激。大量研究證明,睡眠障礙與IL-1β、IL-6、TNF等炎癥介質(zhì)密切相關(guān),炎癥介質(zhì)通過調(diào)控睡眠覺醒周期、影響慢波睡眠而誘導(dǎo)失眠[25-26]。

  總之,舒眠膠囊可能通過調(diào)節(jié)上述基因的表達(dá),調(diào)控炎癥介質(zhì)水平,介導(dǎo)炎癥反應(yīng),達(dá)到改善失眠癥狀的目的。

  3.3舒眠膠囊的成分分析

  槲皮素、山柰酚和木犀草素均為黃酮類化合物,實(shí)驗(yàn)表明,黃酮類化合物可通過消除自由基、抗氧化作用而抑制炎癥、調(diào)節(jié)免疫[27]。槲皮素是自然界分布最廣的類黃酮化合物,具有抗炎、降低細(xì)胞毒性、增加5-羥色胺水平、抑制神經(jīng)遞質(zhì)伽馬氨基丁酸傳遞等作用[28]。木犀草素是燈心草經(jīng)乙酸乙酯提取后含量最大的成分,已知對各種神經(jīng)疾病如癲癇和阿爾茨海默病有神經(jīng)保護(hù)作用,實(shí)驗(yàn)表明木犀草素激活A(yù)1R、A2AR靶點(diǎn)表達(dá),增加小鼠非快速眼動(dòng)睡眠時(shí)間而改善失眠[29]。山柰酚可消除自由基、抗氧化、抑制神經(jīng)元凋亡并促進(jìn)神經(jīng)再生[30],也有研究表明山柰酚通過抑制核因子κB通路的激活,達(dá)到抑制神經(jīng)炎癥及保護(hù)血腦屏障功能而改善大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)功能[31]。β-谷甾醇是一種常見的植物甾醇,可增加5-羥色胺和去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)水平改善失眠,還可減少NO的合成,抑制巨噬細(xì)胞IL-6活性,減少IL-1、TNF等炎癥介質(zhì)的分泌,經(jīng)抗炎作用改善失眠[32]。另外,DXC12、DXC11、DXC5、DXC4均為燈心草菲類衍生物,有實(shí)驗(yàn)表明,燈心草菲類衍生物具有一定抗焦慮及鎮(zhèn)靜作用[33],亦有研究表明DXC5即9,10-二氫類菲可影響小鼠DA及5-羥色胺的代謝,起到抗焦慮活性的作用[34]。

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