摘 要：為比較大腸桿菌(Escherichia coli)O157：H7產毒菌株耐受鹽酸和乳酸的差異性，首先采集309 份牛糞及牛肉樣，進行菌株分離鑒定，接著采用多重聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)方法檢測分離株及其他收集菌株的4 種毒力基因(eae、hly、stx1、stx2)，進而對攜帶毒力基因的產毒菌株分別進行鹽酸和乳酸應激實驗。結果表明：共分離鑒定出8 株大腸桿菌O157菌株，樣品陽性檢出率為2.59%;毒力基因檢測表明，8 株菌株均不攜帶stx1和stx2基因，其中6 株菌株攜帶eae及hly基因;所有產毒菌株耐酸性實驗結果表明，鹽酸或乳酸處理2 h后20 株產毒菌株存活菌數均顯著下降(P<0.05)，但下降程度呈現明顯的菌株差異性，同一菌株對鹽酸、乳酸呈現明顯的耐受差異。

　　關鍵詞：大腸桿菌O157：H7;分離鑒定;耐酸性;菌株差異;產毒菌株

　　腸出血性大腸桿菌(enterohermorrhangic Escherichia coli，EHEC)是一種重要的人畜共患病原菌，也是食品中常見的食源性致病菌之一，O157：H7是其最主要的血清型[1]。大腸桿菌O157：H7感染劑量非常低，該菌吸附在宿主腸上皮細胞表面并分泌志賀毒素(shiga toxin，Stx)，可引起出血性腸炎、繼發性溶血性尿毒綜合癥等嚴重并發癥，重者可導致死亡。大腸桿菌O157：H7對人類健康的威脅已成為主要的世界性公共衛生問題[2-3]。

　　許多食源性致病菌，如大腸桿菌O157：H7、傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌等均為嗜中性菌，即在中性pH值環境下最適合生長，低pH值環境不利于它們的生長繁殖，因此降低pH值是食品加工中抑制致病菌的有效措施。乳酸通常被認為是一種安全的有機酸，歐盟委員會于2013年批準乳酸用于牛胴體表面，以降低微生物污染[4]。此外，機體胃液的低pH值環境可有效殺死食源性致病菌。然而，研究表明大腸桿菌O157：H7具有較高的耐酸性，在pH 2.0～2.5的低酸環境數小時，其生長及繁殖未受到抑制[5-6]，這可能是該菌感染劑量較低的原因之一[7]。

　　關于酸應激對食源性致病菌存活的影響，除了與酸種類有關外[8-9]，還與pH值、作用溫度、持續時間等密切相關[10-11]，

　　且無機酸(如HCl)和有機酸(如乳酸)應激引起的微生物失活機制不同[7，12]。較多研究表明，食源性致病菌對各種應激的耐受性存在菌株差異，而實際食品安全風險監測和控制的對象一般是毒力基因陽性的產毒菌株。因此，本研究首先從牛糞及牛肉樣中分離、鑒定大腸桿菌O157：H7，選取產毒菌株與前期收集的其他產毒菌株一起進行鹽酸和乳酸應激處理，比較不同產毒菌株耐受鹽酸和乳酸的差異，為大腸桿菌O157：H7的風險評估和科學有效控制提供科學依據。

　　1 材料與方法

　　1.1 菌種與試劑

　　前期收集了14 株大腸桿菌O157：H7：其中6 株(編號分別為CICC21530、NCTC12900、89、95、JS2和JS3)由南京農業大學江蘇省動物源食品生產與安全保障重點實驗室惠贈;8 株(編號分別為D1、109、110、111、112、113、114和115)由山東農業大學食品科學與工程學院惠贈。另外，大腸桿菌DH5α由江蘇省疾病控制與預防中心惠贈。

　　改良EC肉湯(mEC+n)(modified E. coli broth)、胰蛋白胨大豆肉湯(tryptic soy broth，TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptic soy agar，TSA)、酵母浸粉(yeast extract，YE)及大腸桿菌O157：H7/NM干制生化鑒定試劑盒 北京陸橋技術有限公司;大腸桿菌O157和H7診斷血清、大腸桿菌O157膠體金快速檢測卡 上海慧耘生物有限公司;科馬嘉CHROMagarTM O157顯色培養基

　　上海欣中生物工程有限公司;抗E. coli O157免疫磁珠 北京東方賽瑞公司;聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)相關試劑 日本TaRaKa公司;大腸桿菌O157：H7的rfbO157、fliCH7、eae、hly、stx1和stx2引物的上、下游序列如表1所示[13-14]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

　　1.2 儀器與設備

　　IS128C pH計 上海儀邁儀器科技有限公司;LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;SG403A Sterile GDRD生物安全柜 美國Baker公司;DHP-9052電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司;ZQTY-70臺式振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司;Mastercycler personal PCR儀 德國Eppendorf公司;Gel Doc 2000 system凝膠成像儀 美國Bio Rad

　　公司;TCL-16G高速離心機 上海安亭儀器廠;2-16KL高速冷凍離心機 美國Sigma公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 樣品采集

　　采集安徽3 個養牛場的牛糞樣250 份，南京集貿市場及超市牛肉樣59 份，共309 份。每份樣品分別放入一次性自封袋內，置于低溫冰盒內于24 h內送至實驗室檢測。

　　1.3.2 大腸桿菌O157：H7的分離、鑒定

　　以無菌操作取待檢樣25 g加入到含有225 mL mEC+n

　　肉湯的均質袋中，在拍擊式均質器上連續均質1～2 min，于(36±1) ℃條件下培養24 h，參考GB 4789.36—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢驗》[15]，應用免疫磁珠法富集菌株，于科瑪嘉O157顯色平板進行分離培養，可疑菌株進行下一步鑒定。

　　1.3.2.1 特異基因的PCR檢測

　　O157特異基因rfbO157反應體系(25 μL)：10×Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、Mg2+1.5 μL、rfbO157上下游引物各0.5 μL、Taq DNA聚合酶0.15 μL，ddH2O補足。rfbO157基因的反應程序：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30 個循環;72 ℃延伸10 min。H7特異基因fliCH7反應體系25 μL：10×Buffer 2.5 μL、

　　25 mmol/L dNTP 0.5 μL、Mg2+1.5 μL、fliCH7上下游引物各0.25 μL、Taq DNA聚合酶0.125 μL，ddH2O補足。fliCH7基因的反應程序：94 ℃預變性7 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30 個循環;72 ℃延伸5 min。引物序列及擴增片段大小如表1所示。

　　1.3.2.2 生化鑒定

　　對O157特異基因rfbO157PCR反應為陽性的可疑菌株，采用北京陸橋公司的DBI-06大腸埃希氏菌O157：H7/NM干制生化鑒定試劑盒進行生化鑒定。

　　1.3.2.3 血清學鑒定

　　對O157特異基因rfbO157 PCR反應為陽性的可疑菌株，用O157和H7診斷血清作玻片凝集實驗。對于H7因子血清不凝集者，穿刺接種半固體瓊脂，檢查動力，經連續傳代3 次，動力實驗均為陰性，確定為無動力株。

　　1.3.2.4 免疫膠體金快速檢測

　　對O157特異基因rfbO157 PCR反應為陽性的可疑菌株，采用上海慧耘公司的Prajina大腸桿菌O157快速檢測卡進行鑒定。

　　1.3.3 毒力基因檢測

　　對前期收集的14 株及上述分離鑒定的菌株進行4 種毒力基因(stx1、stx2、eae、hly)多重PCR擴增，以大腸桿菌CICC21530為陽性對照，以大腸桿菌DH5α為陰性對照，PCR反應體系(50 μL)：10×Buffer 5 μL、10 mmol/L dNTP 1 μL、25 mmol/L Mg2+5 μL、eae上下游引物各1.5 μL、hly上下游引物各0.2 μL、stx1上下游引物各0.8 μL、stx2上下游引物各2.2 μL、Taq DNA聚合酶0.25 μL，ddH2O補足。四重PCR反應程序：94 ℃預變性7 min，94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，25 個循環;72 ℃延伸5 min。

　　1.3.4 產毒菌株耐酸性比較實驗

　　根據毒力基因檢測結果，選取毒力基因陽性菌株分別進行鹽酸、乳酸耐受性比較。

　　菌液制備：將本實驗室分離鑒定的菌株及購買和收集的菌株經TSA劃線培養，37 ℃培養24 h，挑取單菌落接種于3 mL TSB中，37 ℃培養18 h，再轉接至100 mL TSB中，37 ℃培養18～20 h。

　　鹽酸和乳酸應激處理：預實驗發現，采用鹽酸酸化的TSB(pH 3.5)處理菌液時，細菌存活率均較高，故進一步采用鹽酸酸化的TSB(pH 2.0，模擬胃酸)、乳酸酸化的TSB(pH 3.5，模擬一些酸性食品)進行酸應激實驗。

　　取活化2 次后的穩定期菌液10 mL(約

　　9(lg(CFU/mL)))，于4 ℃、9 000×g條件下離心5 min，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)

　　(pH 7.2)洗滌2 次，菌體沉淀分別重懸于等體積的鹽酸酸化的TSB(pH 2.0)和乳酸酸化的TSB(pH 3.5)中，37 ℃應激反應2 h，立即于上述條件下離心，沉淀用PBS洗滌重懸(終止酸應激)[16]，用TSA-YE進行培養計數。實驗重復3 次，取平均值，按照下式進一步計算存活率。

　　1.4 數據處理

　　菌株存活數用lg(CFU/mL)表示，采用SPSS V17.0 軟件進行單因素方差分析，結果顯著性使用Duncan’s多重比較檢驗，P<0.05表示存在顯著性差異。酸應激后菌株存活率采用GraphPad Prism 7軟件進行作圖。

　　2 結果與分析

　　2.1 菌株初步鑒定

　　大腸桿菌O157：H7在科瑪嘉顯色培養基上呈淺紅色至淡紫色，中心灰褐色。大腸菌群呈鐵藍色，變形桿菌等為無色至灰色。結果表明，309 份樣品中存在疑似菌株的有8 份，其中7 份為牛糞樣，1 份為牛肉樣。分離純化得到的疑似菌株進行下一步鑒定。

　　2.2 基因rfbO157和fliCH7的PCR擴增

　　采用PCR方法對疑似菌株進行O型和H型鑒定，以大腸桿菌CICC21530為陽性對照菌株，結果如圖1～2所示，8 株菌的rfbO157基因均為陽性，其中6 株fliCH7基因陽性，2 株fliCH7基因陰性(菌株J29和菌株2G)。表明8 株菌鑒定為大腸桿菌O157，其中6 株菌為大腸桿菌O157：H7。

　　泳道1. 100 bp Ladder Marker;2. 陽性對照(大腸桿菌CICC21530);3. 陰性對照;4～11. 可疑菌株(編號依次為231、232、236、237、241、J29、J42及2G)。圖2同。

　　2.3 生化鑒定結果

　　上述8 株菌株進一步用大腸桿菌O157：H7/NM干制生化鑒定試劑盒進行生化鑒定，結果表明：8 株菌株均能夠發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖和甘露醇;發酵蔗糖，產酸不產氣;M-R實驗、吲哚實驗陽性;VP實驗、檸檬酸鹽利用實驗陰性;不產生硫化氫。以上生化結果與大腸桿菌O157的生化特性相符合。

　　2.4 血清學鑒定結果

　　對PCR鑒定得到的8 株菌進行血清學鑒定，以菌株CICC21530為陽性對照，結果表明，8 株菌均可與O157診斷血清發生凝集，其中有6 株可與H7診斷血清發生凝集，2 株與H7診斷血清不發生凝集(菌株J29和菌株2G)，血清學實驗結果與PCR鑒定結果一致。

　　2.5 免疫膠體金快速檢測結果

　　采用大腸桿菌O157膠體金快速檢測卡對上述8 株菌株進一步進行檢測，以菌株CICC21530為陽性對照。陽性結果：C線顯色，T線肉眼可見;陰性結果：C線顯色，T線不顯色。結果表明，8 株菌均呈陽性，與rfbO157基因的PCR鑒定結果(圖1)一致。部分菌株檢測結果如圖3所示。

　　綜合以上實驗結果，本研究檢出大腸桿菌O157陽性的樣品共8 份，陽性檢出率為2.59%(8/309)，其中牛糞陽性檢出率為2.80%(7/250)，牛肉陽性檢出率為1.69%(1/59)，牛糞陽性檢出率高于牛肉。陳雅君等[17]報道，糞便樣中陽性檢出率為0.67%，而牛乳和鮮肉中陽性檢出率為0%。Uhitil等[18]也報道，在牛肉和牛肉制品中沒有檢測到大腸桿菌O157。然而，另一些研究報道，在南非和馬來西亞的牛肉樣中，大腸桿菌O157陽性檢出率分別為74.5%和36.0%[19-20]，顯著高于本研究中牛肉樣的陽性檢出率。楊一群等[21]也報道，117 份食品樣中有55 份為rfbO157基因陽性，即大腸桿菌O157陽性檢出率高達47.01%。上述研究報道的差異與地區、牛群飼養管理、屠宰環境及屠宰工藝等有關。本研究的牛肉中檢出大腸桿菌O157，提示應在加強防控大腸桿菌O157糞源污染的同時，更應高度關注生肉及相關食品中致病菌的安全監測。

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