【摘要】 目的 研究膽囊腺癌、癌旁組織、慢性膽囊炎組織中蛋白基因產物9.5(PGP9.5)表達及其臨床病理意義。方法 108例膽囊腺癌、46例癌旁組織和35例慢性膽囊炎切除標本常規石蠟包埋切片，PGP9.5染色方法為EnVisionTM免疫組化法。結果 膽囊腺癌PGP9.5表達陽性率(45.4%)和評分(1.94±1.84)明顯高于癌旁組織(17.4%，X2=10.83，P<0.01;0.86±1.41，t=3.60，P<0.01)和慢性膽囊炎組織(11.4%，X2=13.06，P<0.01;0.58±1.29，t=4.08，P<0.01);PGP9.5陽性良性病變膽囊上皮均呈中至重度不典型增生。患者年齡≤45歲、腺瘤癌變或高分化腺癌、腫塊最大徑<2 cm、無淋巴結轉移和未侵犯周圍組織病例PGP9.5表達陽性率及其評分明顯低于年齡>45歲、低分化腺癌、腫塊最大徑≥2 cm、淋巴結轉移和侵犯周圍組織病例(P<0.05或P<0.01)。結論 PGP9.5表達可能是反映膽囊腺癌發生、進展和預后的重要生物學標志物，檢測膽囊良性病例PGP9.5表達水平對于預防和早期發現膽囊癌可能有重要臨床意義。
【關鍵詞】 膽囊腫瘤 慢性膽囊炎 蛋白基因產物9.5 免疫組織化學
Abstract Objective To study the expression of PGP9.5 and its clinicopathological significances in tissues of gallbladder adenocarcinoma， pericancerous tissues and chronic cholecystitis. Methods Immunohistochemical method was used for the detection of PGP9.5 expressive levels in routinely paraffin-embedded sections from the specimens of gallbladder adenocarcinoma (n=108)， pericancerous tissues (n=46) and chronic cholecystitis (n=35). Results The positive rates and scores of PGP9.5 in gallbladder adenocacrcinoma (45.4%， 1.94±1.84) were significantly higher than those in pericancerous tissues (17.4%， X2=10.83， P<0.01; 0.86±1.41， t=3.60， P<0.01) and chronic cholecysitis (11.4%， X2=13.06， P<0.01; 0.58±1.29， t=4.08， P<0.01). The positive rates and scores of PGP9.5 were significantly lower in the cases of aged ≤45 years， adenomatous canceration or high-differentiatied adenocarcinoma， maximal diameter of mass <2 cm， no-metastasis of lymphnode， and no-invasion of regional tissues than those in the ones of aged >45 years， low-differentiated adenocarcinoma， maximal diameter of mass ≥2 cm， metastasis of lymphnode and invasion of regional tissues. Conclusion The expressive levels of PGP9.5 may be an important marker for reflecting the carcinogenesis， progression， biological behaviors and prognosis of gallbladder adenocarcinoma. The assayes of PGP9.5 expressive levels in benign lesions of gallbladder may have important clinical values for the prevention and early-stage finding of gallbladder carcinoma.
Key words gallbladder neoplasms; chronic cholecystitis; protein gene product 9.5; immunohistochemistry 蛋白基因產物9.5(protein gene product 9.5， PGP9.5)是一種分子量為27KD的神經元特異性蛋白質，為神經內分泌腫瘤的標志物。但新近發現PGP9.5不僅在神經內分泌腫瘤細胞表達，也可在其他上皮源性腫瘤細胞中表達，且其表達水平與上皮源性惡性腫瘤發生、進展及預后有密切關系[1-6]。國內外尚未見膽囊良惡性病變組織中PGP9.5表達研究的文獻報道。我們應用EnVisionTM免疫組化方法研究膽囊腺癌、癌旁組織和慢性膽囊炎組織中PGP9.5表達水平及其臨床病理意義。
1 材料和方法
1.1 標本及臨床病理資料 收集湘雅二醫院、湘雅醫院和湖南省人民醫院1996年6月至2006年6月間膽囊癌手術切除標本108例，男性31例(28.7%)，女性77例(71.3%)。病理類型均為腺癌，其中腺瘤癌變9例(8.2%)，高分化腺癌29例(26.9%)，中分化腺癌29例(26.9%)，低分化腺癌30例(27.8%)，黏液腺癌11例(10.2%);術中發現侵犯膽囊外周圍組織器官59例(54.6%);共有59例發生區域淋巴結轉移(54.6%);58例伴有膽囊結石(53.7%);手術方式包括根治性切除34例(31.5%)，姑息手術48例(44.4%)和因廣泛轉移不能手術僅取轉移灶癌組織26例(24.1%)。從以上108例膽囊腺癌中選擇46例癌旁組織(距癌組織≥3 mm)，其中正常10例、輕度不典型增生10例，中度不典型增生12例和重度不典型增生14例。另收集35例慢性膽囊炎組織標本(單純慢性膽囊炎15例、慢性膽囊炎伴膽囊結石20例)作為對照，其中正常膽囊黏膜11例、輕度不典型增生12例、中度不典型增生7例及重度不典型增生5例。以上標本經4%甲醛固定后常規制作石蠟包埋切片，切片厚4 ?滋m。
1.2 主要試劑 兔抗人PGP9.5多克隆抗體購自北京金橋中杉生物技術公司， EnVisionTM探查試劑盒(兔/鼠)購自上海基因技術有限公司。
1.3 方法 PGP9.5染色方法為EnvisionTM二步免疫組化法，主要步驟：切片脫蠟至水洗→3% H2O2甲醇液15 min→流水沖洗，0.125% EDTA抗原修復液15 min→流水沖洗，蒸餾水洗→滴加兔抗人PGP9.5多克隆抗體(1/100) 37℃ 60 min→0.01 mol/L PBS(pH7.4)洗3次×5 min→滴加A液37℃ 30 min→0.01 mol/L PBS液洗3次×5 min→滴加DAB顯色液15 min→流水沖洗→蘇木素液 1 min→流水返蘭15 min→脫水，透明、中性樹膠封固。細胞漿內含棕黃色顆粒者為陽性細胞，評分標準：將切片中細胞漿著色強度評分(無，0分;弱， 1分;中，2分;強，3分)和切片中陽性細胞率評分(≤5%，0分;6%～10%，1分;11%～20%，2分;21%～50%，3分;>50%，4分)之和為該切片評分值，將評分值≤2分定為陰性病例，≥3分定為陽性病例。以北京金橋中杉生物技術公司提供的陽性切片作為陽性對照，以0.01 mol/L PBS液(pH7.4)替代一抗作為陰性對照。統計學方法：將所得數據輸入至 SPSS 13.0統計軟件中進行t檢驗、F檢驗或Fishers精確概率法，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 PGP9.5在膽囊良惡性病變中表達情況 PGP9.5免疫組化反應陽性產物定位于胞漿(見圖1，2)。108例膽囊腺癌PGP9.5表達陽性病例49例(45.4%)，其評分均值為1.94±1.84;46例癌旁組織PGP9.5陽性8例(17.4%)，其評分均值為0.86±1.41;35例慢性膽囊炎PGP9.5陽性病例為4例(11.4%)，其評分均值為0.58±1.29;PGP9.5表達陽性的癌旁組織和慢性膽囊炎病例膽囊黏膜上皮均呈中至重度不典型增生。膽囊腺癌PGP9.5表達陽性率及其評分均值明顯高于癌旁組織(X2=10.83，P<0.01;t=3.60，P<0.01)和慢性膽囊炎組織(X2=13.06，P<0.01;t=4.08，P<0.01)。
2.2 PGP9.5表達與膽囊腺癌臨床病理特征的關系
腺瘤癌變或高分化腺癌、腫塊最大徑<2 cm、無淋巴結轉移及未侵犯周圍組織病例PGP9.5表達陽性率及其評分明顯低于低分化腺癌、腫塊最大徑≥2 cm、淋巴結轉移及侵犯周圍組織病例(P<0.05或P<0.01)。見表1。
3 討論
PGP9.5是一個泛素水解酶，它廣泛表達于神經元分化的各個階段，為神經內分泌系統的一個特定組織標志物。當前積累的資料顯示泛素羧基末端羥化酶家族在細胞的蛋白水解途徑中起調節細胞周期和死亡的重要作用，蛋白去泛素化與細胞周期調節及惡性腫瘤發生發展的關系近年來日漸引起關注。PGP9.5介導的針對細胞蛋白的泛素——蛋白酶體系統，可能是調節細胞周期基因的重要機制，通過引起細胞周期蛋白的去泛素化增加促進未分化的體細胞無序生長和繁殖，同時PGP9.5的表達可能誘導一些能影響細胞分裂周期的基因[1-6]。因此PGP9.5在調節細胞周期蛋白表達方面具有重要作用，從而與惡性腫瘤發生發展及預后有重要關系。Hibi等[1]發現PGP9.5表達不僅與小細胞肺癌發生、進展及預后有關，而且也與非小細胞肺癌發生、進展及預后有密切關系，高表達者進展快、易發生轉移、侵襲潛力強及預后差，認為PGP9.5的表達是不依賴神經分泌而獨立存在的和肺癌病理分期及預后相關的重要生物學指標。此后，國外學者相繼研究了胃癌、食管癌、腸癌和甲狀腺髓樣癌PGP9.5表達及甲基化水平，均發現部分惡性腫瘤PGP9.5高表達，其表達水平及甲基化水平與惡性腫瘤發生、進展、轉移、侵襲、臨床病理分期及預后密切相關，高表達者及高甲基化水平者進展快、易發生轉移、侵襲潛力強、臨床病理分期高及預后差，而其相應來源的正常組織及良性病變組織PGP9.5呈低表達或不表達[2-6]。
本組資料顯示，膽囊腺癌PGP9.5表達陽性率及其評分明顯高于癌旁組織和慢性膽囊炎(P<0.01);PGP9.5陽性表達的癌旁組織和慢性膽囊炎膽囊上皮均呈中至重度不典型增生;腺瘤癌變或高分化腺癌、腫塊最大徑<2 cm，無淋巴結轉移、未侵犯膽囊外周圍組織病例PGP9.5表達陽性率及其評分明顯低于低分化腺癌、腫塊最大徑≥2 cm、淋巴結轉移及侵犯周圍組織病例。其結果與國外學者在其他惡性腫瘤中的研究結果較一致，說明PGP9.5陽性的膽囊腺癌可能進展快、生長速率高，易發生淋巴結轉移及侵犯周圍組織器官，PGP9.5表達水平可能是評估膽囊腺癌進展、生物學行為和預后的重要生物學標志物，其作用機制可能與其調控細胞周期蛋白基因有關，但有待更深一步研究。
【參考文獻】
[1] Hibi K， Westra WH， Borges M， et al. PGP9.5 as a candidate tumor marker for non-small-cell lung cancer[J]. Am J Pathol，1999，155(3)：711-715.
[2] Yamashita K， Park HL， Kim MS， et al. PGP9.5 methylation in diffuse-type gastric cancer[J]. Cancer Res，2006，66(7)：3921-3927.
[3] Mandelker DL， Yamashita K， Tokumaru Y， et al. PGP9.5 promoter methylation is an independent prognostic factor for esophageal squamous cell carcinoma[J]. Cancer Res，2005，65(11)：4963-4968.
[4] Yamazaki T， Hibi K， Takase T， et al. PGP9.5 as a marker for invasive colorectal cancer[J]. Clin Cancer Res，2002，8(1)：192-195.
[5] Takano T， Miyauchi A， Matsuzuka F， et al. PGP9.5 mRNA could contribute to the molecular-based diagnosis of medullary thyroid carcinoma[J]. Eur J Cancer，2004，40(4)：614-618.
[6] Takase T， Hibi K， Yamazaki T， et al. PGP9.5 over expression in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Hepatogastroenterology，2003，50(53)：1278-1280.
