〔摘要〕 目的 通過觀察益氣活血中藥組方加味丹參飲(JWDS)對(duì)心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury， MIRI)模型大鼠血清硫化氫(H2S)合成酶/胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyse， CSE)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes， CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase， DH)含量、心肌組織超微結(jié)構(gòu)、心肌組織CSE mRNA表達(dá)的影響，從內(nèi)源性H2S合成途徑探討JWDS治療MIRI的作用機(jī)制。方法 給藥組大鼠按劑量6.19 g/(kg·d)要求給藥14 d，末次給藥2 h后采用結(jié)扎冠脈左前降支/再灌流方法復(fù)制MIRI模型。HE染色觀察心肌組織機(jī)構(gòu)改變情況;ELISA法檢測(cè)血清CK、LDH、CSE含量;Western-blot檢測(cè)心肌組織CSE蛋白表達(dá);Real-time PCR檢測(cè)心肌組織CSE mRNA表達(dá)。結(jié)果 JWDS可明顯改善MIRI模型大鼠心肌組織病理改變，降低血清LDH、CK含量(P<0.01)，升高CSE含量(P<0.01)，上調(diào)心肌組織CSE及mRNA表達(dá)(P<0.05，P<0.01)。PPG可明顯降低JWDS組大鼠血清CSE含量(P<0.01)，下調(diào)心肌CSE mRNA表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論 JWDS對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血/再灌注(MIR)大鼠心肌損傷具有明顯保護(hù)作用，其機(jī)制與促進(jìn)內(nèi)源性H2S生成從而保護(hù)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，抑制CK、LDH漏出，上調(diào)心肌組織CSE蛋白及mRNA表達(dá)有關(guān)。

　　〔關(guān)鍵詞〕 心肌缺血再灌注;加味丹參飲;益氣活血; H2S;CSE

　　心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury， MIRI)是指心肌缺血后冠狀動(dòng)脈再通，恢復(fù)供血后導(dǎo)致的復(fù)雜心肌損傷反應(yīng)，是導(dǎo)致溶栓治療、心臟移植及冠脈搭橋等治療手段失敗的主要原因[1-4]。MIRI可導(dǎo)致包括再灌注性心律失常、心肌頓抑、血液無復(fù)流、微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及微循環(huán)障礙等在內(nèi)的一系列功能、結(jié)構(gòu)、代謝方面的損傷，臨床治療心血管疾病應(yīng)盡量避免MIRI帶來的負(fù)面作用，對(duì)MIRI的臨床表現(xiàn)、發(fā)病機(jī)制以及防治途徑的研究具有重要意義[5-6]。硫化氫(H2S)是一種類似于一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)的內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，主要由胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyse， CSE)催化底物L(fēng)-半胱氨酸生成[7]。研究發(fā)現(xiàn)H2S可自由穿過細(xì)胞膜，是細(xì)胞防御的內(nèi)源性機(jī)制，外源性H2S干預(yù)對(duì)離體心臟缺血預(yù)處理具有明顯的保護(hù)作用[8]。

　　加味丹參飲(JWDS)是跟據(jù)大量臨床經(jīng)驗(yàn)，從《時(shí)方歌括》丹參飲化裁而來，由黃芪、丹參、檀香、川芎、赤芍等組成，全方共奏益氣活血之功，在臨床上對(duì)防治冠心病心絞痛有很好的療效。部分研究證實(shí)該方可通過調(diào)控細(xì)胞凋亡、抗炎等有效途徑的減輕心肌缺血再灌注損傷。但其多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)作用的確切機(jī)制還未完全闡明。為探究是否通過內(nèi)源性H2S調(diào)節(jié)通路對(duì)MIRI發(fā)揮治療作用，本實(shí)驗(yàn)通過觀察加味丹參飲JWDS對(duì)MIRI模型大鼠心肌組織細(xì)胞形態(tài)、血清合成酶/胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyse， CSE)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes， CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase， DH)含量、心肌組織CSE及mRNA表達(dá)的影響，以及H2S合成酶抑制劑PPG對(duì)JWDS治療效果的影響，進(jìn)一步闡釋JWDS保護(hù)MIRI的作用機(jī)制。

　　1 材料

　　1.1 動(dòng)物

　　SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK(湘)2014-0008。

　　1.2 主要藥物與試劑

　　加味丹參飲(由丹參、檀香、赤芍、川芎、當(dāng)歸、紅花、生地黃、黃芪等組成)，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供;LDH、CK、CSE ELISA試劑盒均購(gòu)于武漢基因美生物，批號(hào)201804;硫氫化鈉(NaHS)，美國(guó)Sigma公司;RIPA(強(qiáng))組織細(xì)胞快速裂解液(批號(hào)PAB180006)、Goat-anti-rabbit IgG二抗(批號(hào)PAB150011)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(批號(hào)PAB180007)均購(gòu)于BIOSWAMP公司;Anti-rabbit CSE抗體(批號(hào)Ab80643)、Anti-rabbit抗β-Actin抗體(批號(hào)Ab8227)均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司;Trizol試劑(批號(hào)15596026)，ambion公司;YBR Green PCR試劑盒(批號(hào)KM4101)，KAPA Biosystems公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)639505)，TAKARA公司。

　　1.3 儀器

　　小動(dòng)物呼吸機(jī)(DW-3000，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司);FX-211小動(dòng)物心電圖機(jī)(北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司);MK3型酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃);AC8型自動(dòng)洗板機(jī)(Thermo公司);TG16W型微量高速離心機(jī)(湖南湘儀);GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏);mini protean 3 cell型電泳儀、Real-time PCR、Universal Hood Ⅱ型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD);K30型干式恒溫器(杭州爽盛儀器);Centriguge 5424 R型離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf);Tanon-5200型ECL分析儀(上海天能)。

　　2 實(shí)驗(yàn)方法

　　2.1 分組與給藥

　　取SD大鼠70只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、MIRI模型組(MIRI組)、缺血預(yù)適應(yīng)組(IP組)、NaHS+MIRI組(NaHS組)、加味丹參飲+MIRI組(JWDS組)、加味丹參飲+PPG+MIRI組(JWDS+PPG組)，每組10只。JWDS組與JWDS+PPG組每日以加味丹參飲(6.19 g/kg)灌胃，JWDS+PPG組于再灌注前30 min以CSE合成酶抑制劑PPG(33.9 mg/kg)腹腔注射干預(yù)，NaHS組以28 μmol/kg NaHS腹腔注射，空白組、假手術(shù)組、MIRI、IP組以等量生理鹽水灌胃，給藥體積均為10 mL/kg。每日給藥1次，連續(xù)14 d。

　　2.2 缺血再灌注模型建立

　　末次給藥2 h后建立MIRI模型。除空白組外，各組大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定于解剖臺(tái)上，頸部備皮消毒。切開氣管，以8號(hào)灌胃針進(jìn)行氣管插管，動(dòng)物呼吸機(jī)(呼吸頻率60～80次/min，潮氣量5～7 mL)輔助呼吸。沿第3/4肋骨上緣打開胸腔暴露心臟，剪開心包，沿冠狀動(dòng)脈于左前降支下方約2 mm處用無創(chuàng)縫合線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，連續(xù)監(jiān)視心電圖的變化，出現(xiàn)ST段弓背抬高，T波高聳/倒置或左心室變?yōu)樯n白色即確認(rèn)阻斷成功。30 min后放松結(jié)扎線，再灌注90 min以ST 段回落1/2以上，T波下降或左心室由蒼白變?yōu)榘导t色表示再灌注成功。假手術(shù)組僅做開胸處理，不結(jié)扎。

　　2.3 HE染色觀察心肌組織病理變化

　　取大鼠心肌組織，10%多聚甲醛浸泡固定，石蠟包埋，間斷連續(xù)切片，HE染色，正置顯微鏡下觀察心肌組織病理變化并拍照。

　　2.4 ELISA檢測(cè)大鼠血清CSE、CK、LDH含量

　　大鼠心肌缺血/再灌注24 h后，脫頸處死大鼠，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，取上清，分裝后置于-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩⒄誆LISA試劑盒說明，檢測(cè)血清CSE、CK、LDH含量。

　　2.5 Western blot檢測(cè)心肌組織CSE表達(dá)

　　取大鼠左心室心肌組織，加入預(yù)冷RIPA裂解液研磨，提取總蛋白，測(cè)定蛋白含量。制備好的蛋白樣品，經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜后置于含5%脫脂奶粉封閉液中封閉2 h，Anti-rabbit CSE/β-actin一抗(CSE 1∶1 000稀釋;β-Actin1∶10 000稀釋)4 ℃下孵育過夜。加HRP標(biāo)記的Goat-anti-rabbit IgG二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育1 h后，加入ECL發(fā)光液顯影，ECL分析系統(tǒng)檢測(cè)并拍照，Image J軟件計(jì)算條帶吸光度值。

　　2.6 Real-time PCR檢測(cè)心肌組織CSE mRNA表達(dá)

　　再灌注結(jié)束后取大鼠左心室組織，Trizol試劑冰上提取總RNA后，測(cè)定樣品RNA純度及濃度。以總RNA為模板，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列：CSE-F：CCACCACAACGATTACCC;CSE-R：AGTCCAAACTCGGATGCC，引物長(zhǎng)度：112 bp;β-Actin-F：CGTTGACATCCGTAAAGAC;β-Actin-R：TAGGAGCCAGGGCAGTA，引物長(zhǎng)度：110 bp。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃ 5 s，56 ℃10 s，72 ℃ 25 s循環(huán) 40 次。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算CSE mRNA相對(duì)表達(dá)量。

　　2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　所有數(shù)據(jù)以Excel表格進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，Graphpad prism 7軟件進(jìn)行分析。結(jié)果以“x±s”表示，組間比較以one-way ANOVA單因素方差分析及q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　3 結(jié)果

　　3.1 JWDS對(duì)MIRI模型大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)的影響

　　與空白組比較，模型組大鼠心肌組織局部壞死，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，邊界不清，胞內(nèi)水腫明顯，心肌細(xì)胞走形紊亂。與模型組比較，JWDS組大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)明顯改善，細(xì)胞走形規(guī)律，輪廓完整，水腫程度減輕，JWDS+PPG組大鼠心肌組織壞死程度加重，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多。見圖1。

　　3.2 JWDS對(duì)MIRI模型大鼠血清CSE、CK、LDH含量的影響

　　與空白組比較，模型組大鼠血清LDH、CK含量明顯升高(P<0.01)，CSE含量明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，JWDS組LDH、CK含量明顯降低(P<0.01)，CSE含量明顯升高(P<0.01)。與JWDS組比較，JWDS+PPG組CSE含量明顯降低(P<0.01)。

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