摘要：構建了原核表達質粒pET-28a-N，經原核表達純化獲得小反芻獸疫病毒N蛋白。將純化的小反芻獸疫病毒N蛋白與對應的酶標二抗配對，通過對各個反應條件的優化建立了間接化學發光抗體檢測方法。通過對血清樣本的檢測，對該方法的敏感性、特異性、重復性、符合率進行了評價。試驗結果顯示：N蛋白最適包被濃度為0.5 μg/mL，最適包被條件為4℃ 24 h;酶標二抗最適工作濃度為1∶2000。特異性試驗證明，該方法與羊常見病毒的抗體陽性血清沒有交叉反應。通過檢測大量小反芻獸疫病毒抗體陰、陽型血清，確定了科學的判定標準。
關鍵詞：原核表達;最適條件;臨界值
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小反芻獸疫(Peste des Petits Ruminants，PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus，PPRV)引起的一種反芻動物的烈性病毒性疾病。小反芻獸疫病毒具有高度傳染性，綿羊和山羊為主要感染動物，偶爾感染野生小反芻動物，例如巖羊、野山羊等[1]。世界動物衛生組織(OIE)將其列為必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。在《2018年國家動物疫病強制免疫計劃》規定對全國所有羊進行小反芻獸疫免疫。本試驗利用原核表達的小反芻獸疫N蛋白作為包被抗原與其酶標二抗配對，構建了間接化學發光抗體檢測方法。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 主要試劑
pET-28a原核表達載體、BL21感受態細胞由本公司實驗室保存;法國ID-VET《小反芻獸疫抗體檢測試劑盒》購于上海拜力生物科技有限公司;小反芻獸疫活疫苗(Clone9株)購于新疆天康畜牧生物技術股份有限公司。
1.1.2 血清樣本
小反芻獸疫陽性血清、小反芻獸疫陰性血清購于中國獸醫微生物菌種保藏管理中心。500份已知來源的臨床羊血清由洛陽萊普生信息科技有限公司提供，并經法國ID-VET小反芻獸疫病毒阻斷ELISA抗體檢測試劑盒檢驗證明。
1.2 方法
1.2.1 小反芻獸疫N蛋白的表達
小反芻獸疫病毒是單股負鏈RNA病毒，編碼8種已知蛋白，其中6種為結構蛋白，分別為核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、大蛋白(L)、血凝素蛋白(H)和融合蛋白(F)。大多數血清學檢測技術是針對小反芻獸疫病毒的核衣殼蛋白和血凝素蛋白而建立的[2]。大多數的單鏈RNA病毒，包括小反芻獸疫病毒在內，N蛋白高度保守，免疫原性也較高。由于接近病毒基因組的3'末端，N蛋白的含量比其他結構蛋白都要高。雖然針對N蛋白的抗體不能保護動物免受該病侵害，但由于抗原性較好而且含量豐富，N蛋白仍然是小反芻獸疫診斷工具最易接受的目標[3]。
從gene bank上查找小反芻獸疫N蛋白的基因序列號為AJ563705.1，并設計引物。上游引物序列為：5'-AATAGGATCCGCG CACGTGAACGACATGCTGA -3'，下游引物序列為：5'-CGGAAGCTTAATGTCGTAGAACTTGAGCGTGTG-3'。使用RNA提取試劑盒從小反芻獸疫疫苗中提取病毒核酸。并通過反轉錄PCR獲得cDNA，使用上述一對引物擴增出小反芻獸疫N蛋白主要抗原表位區基因。將擴增出來的目的基因、pET-28a空載體分別經雙酶切之后與pET-28a載體連接。將重組質粒轉化BL21大腸桿菌感受態細胞。經過條件篩選，確定合適的IPTG誘導濃度，培養溫度。經表達純化獲得的小反芻獸疫N蛋白可作為試劑盒生產中的包被抗原使用。
1.2.2 包被緩沖液的選擇
分別選取25mM PBS(pH值7.4)、碳酸鹽緩沖液(pH值9.6)、50mM Tris-HCl(pH值8.0)作為包被緩沖液，包被濃度均為1 μg/mL。每孔100 μL，2～8℃放置24 h。用PBST洗板2次，每孔加入1.5% BSA，2～8℃封閉24 h。陽性對照血清1/20稀釋之后加入到化學發光反應板中，每孔加入100 μL，最后一行作為無血清對照。37℃反應1 h，PBST洗滌5次，吸水紙上拍干之后，每孔加入100 μL工作濃度的羊抗豬酶標二抗。37℃反應1 h，PBST洗滌5次，吸水紙上拍干之后，每孔加入化學發光底物A液50 μL、化學發光底物B液50 μL。室溫、避光反應5 min，使用化學發光免疫分析儀讀數。
1.2.3 包被條件的摸索
分別選取37℃ 3 h、4℃ 16 h、4℃ 24 h、三種包被條件進行摸索。以1 μg/mL的蛋白濃度進行包被，每孔加入100 μL。使用1.5% BSA封閉，陽性對照血清1/20稀釋之后加入化學發光反應板進行反應。選擇化學發光值高，并且變異系數最小的條件進行包被。
1.2.4 封閉緩沖液的選擇
分別選取 1.5% BSA、1%酪蛋白、10%馬血清、3%明膠作為封閉液。封閉條件為2～8℃24 h。在化學發光反應板上測定陽性對照血清、陰性對照血清，計算二者化學發光值的比值(P/N)，根據比值大小確定最適封閉液。
1.2.5 血清稀釋倍數和抗原包被濃度的確定
使用棋盤滴定法來篩選最佳條件。使用包被緩沖液在化學發光包被板上按照濃度梯度進行包被。選取陽性對照血清、陰性對照血清進行梯度稀釋，進行測定。實驗布局如表1所示。根據最終讀取的化學發光值計算陽性對照血清、陰性對照血清二者的比值(P/N)，比值最大時為最適抗原包被濃度與血清稀釋倍數。
