細胞焦亡作為機體重要的天然免疫反應(yīng)，在拮抗和清除病原菌感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)革蘭氏陰性菌侵入宿主細胞后，其外膜的重要病原分子模式LPS(脂多糖，也稱內(nèi)毒素)會被宿主細胞內(nèi)的天然免疫受體caspase-4/5/11識別，LPS激活的caspase-4/5/11會進一步切割活化焦亡蛋白GSDMD釋放其膜打孔活性，導(dǎo)致細胞焦亡，激發(fā)宿主的抗菌炎癥反應(yīng)。同時，細菌也采用了多種策略來逃避宿主的免疫防御，例如通過獨特的III型分泌系統(tǒng)向宿主細胞"注入"專門的效應(yīng)蛋白，干擾宿主的免疫防御通路。2021年，北京生命科學(xué)研究所邵峰團隊發(fā)現(xiàn)痢疾桿菌(Shigella)分泌的效應(yīng)蛋白OspC3可以特異識別宿主細胞內(nèi)的天然免疫受體caspase-4/11，通過催化caspase酶活中心的關(guān)鍵精氨酸發(fā)生一種全新的ADP-riboxanation翻譯后修飾使caspase-4/11失活，阻斷其活化下游GSDMD介導(dǎo)的細胞焦亡免疫防御。然而效應(yīng)蛋白OspC3是如何特異地識別宿主靶標(biāo)caspase-4/11，又是如何催化新穎的ADP-riboxanation修飾拮抗細胞焦亡的精確分子機理等關(guān)鍵科學(xué)問題有待進一步回答。

　　2023年1月9日，中科院生物物理研究所王大成/丁璟珒課題組和北生所邵峰團隊合作，在《Nature Structural & Molecular Biology》發(fā)表題為"Structural mechanisms of calmodulin activation of Shigella effector OspC3 to ADP-riboxanate caspase-4/11 and block pyroptosis"的研究論文。該研究揭示了效應(yīng)蛋白OspC3利用宿主細胞的鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)作為輔助因子激活其酶學(xué)活性，特異地識別宿主靶標(biāo)caspase-4/11并催化全新的精氨酸ADP-riboxanation修飾，阻斷宿主細胞caspase-4/11-GSDMD焦亡通路的完整分子機理。

　　研究人員首先發(fā)現(xiàn)OspC3可以有效地對靜息狀態(tài)未發(fā)生自剪切的caspase-4/11和細菌LPS激活后發(fā)生了自剪切的caspase-4/11兩種形式進行修飾，但是激活形式的caspase-4/11活性中心如果被模擬底物切割位點四肽序列的共價抑制劑zVAD不可逆地占據(jù)，會極大地削弱OspC3對caspase-4/11的修飾，這表明底物非結(jié)合狀態(tài)的caspase-4/11，不論激活與否都是OspC3的底物。研究人員隨后發(fā)現(xiàn)，ADP-核糖基特異性結(jié)合蛋白Af1521可與修飾后的caspase-4/11產(chǎn)物形成穩(wěn)定的1:1復(fù)合物，通過解析Af1521與caspase-4被修飾后產(chǎn)物的復(fù)合物的高分率晶體結(jié)構(gòu)，研究人員首次清晰地觀察到ADP-riboxanation修飾的精確化學(xué)結(jié)構(gòu)，caspase-4修飾位點R314的側(cè)鏈胍基脫去一個末端Nω原子后與來自NAD+的ADP-核糖基核糖環(huán)上的C1原子和C2位羥基分別連接，形成了一個全新的五元惡唑烷環(huán)，該結(jié)果為精氨酸ADP-riboxanation這種全新的翻譯后修飾提供了直接的結(jié)構(gòu)證明。

　　OspC3及其所屬的細菌效應(yīng)蛋白家族具有典型的雙結(jié)構(gòu)域特征，其N端結(jié)構(gòu)域和任何已知的蛋白質(zhì)沒有序列同源性，而C端包含一個保守的ankyrin-repeat結(jié)構(gòu)域(ARD)，這類結(jié)構(gòu)域通常介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用，因此推測該結(jié)構(gòu)域是OspC3的底物識別結(jié)構(gòu)域。研究人員進一步通過解析OspC3 ARD結(jié)構(gòu)域與caspase-4底物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，確定了OspC3 ARD結(jié)構(gòu)域通過一系列氫鍵網(wǎng)絡(luò)和疏水作用特異地招募宿主靶標(biāo)caspase-4/11。

　　在體外重組OspC3修飾caspase-4/11的酶活實驗中，研究人員發(fā)現(xiàn)OspC3需要幾乎與底物蛋白caspase-4/11相當(dāng)?shù)牧坎拍軐崿F(xiàn)對底物的完全修飾，這有悖于酶催化底物反應(yīng)高效性的經(jīng)典認識。通過免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜的方法，研究人員鑒定出宿主的鈣調(diào)蛋白CaM以Ca2+-free的形式與OspC3形成穩(wěn)定的二元復(fù)合物，極大地提高了OspC3的催化效率。隨后，研究人員成功地解析了OspC3與CaM二元復(fù)合物的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Ca2+未結(jié)合狀態(tài)的CaM通過兩個亞結(jié)構(gòu)域分別以廣泛的疏水作用牢牢抓住OspC3的N端結(jié)構(gòu)域，而OspC3的N端結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)出經(jīng)典Rossmann折疊構(gòu)象，與已知的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域具有相似的結(jié)構(gòu)特征和保守的NAD+結(jié)合基序。為了進一步闡明OspC3利用NAD+作為供體催化caspase-4/11的精氨酸發(fā)生ADP-riboxanation修飾的完整酶學(xué)機理，研究人員又成功解析了OspC3-CaM-caspase-4三元復(fù)合物及其與2-F-NAD+(非水解型NAD+類似物)的四元復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)OspC3的N端的酶活中心通過酸性氨基酸D231固定caspase-4活性中心R314側(cè)鏈胍基的末端Nω原子，使ADP-核糖基C1位靠近R314胍基的Nδ原子，從而利于NAD+煙酰胺基團的離去和在修飾位點R314 Nδ原子上發(fā)生第一步經(jīng)典的ADP-核糖基修飾;而酶活中心的另一個酸性氨基酸D177則負責(zé)激活A(yù)DP-核糖基C2位的羥基親核進攻R314側(cè)鏈胍基C原子發(fā)生脫氨反應(yīng)，使精氨酸側(cè)鏈胍基和ADP-核糖基團形成一個惡唑烷環(huán)。隨后，研究人員將結(jié)構(gòu)研究的發(fā)現(xiàn)利用定點突變的方法在生化、細胞和Shigella感染小鼠三個層面進行了驗證，完整地闡明了OspC3利用宿主輔因子CaM特異的對caspase-4/11進行精氨酸ADP-riboxanation修飾的分子機理。

　　這項研究工作通過一系列三維結(jié)構(gòu)分析與功能實驗驗證，揭示了痢疾桿菌效應(yīng)蛋白OspC3特異地識別宿主天然免疫受體caspase-4/11，并利用宿主鈣調(diào)蛋白CaM作為輔因子催化全新的精氨酸ADP-riboxanation修飾，阻斷宿主細胞caspase-4/11-GSDMD焦亡防御通路的完整分子機理，也為ADP-riboxanation這種全新的翻譯后修飾的酶學(xué)反應(yīng)機理提供了全面深入的理解，為進一步尋找和開發(fā)新型抗菌藥物或細菌減毒疫苗提供了新策略。

　　圖 痢疾桿菌效應(yīng)蛋白OspC3拮抗宿主細胞焦亡通路的分子機理

　　A. 痢疾桿菌效應(yīng)蛋白OspC3阻斷caspase-4/11焦亡通路拮抗宿主天然免疫的模式圖;B. OspC3-CaM-caspase-4-2-F-NAD+四元復(fù)合物結(jié)構(gòu)及催化關(guān)鍵殘基展示;C. 精氨酸ADP-riboxanation修飾后的caspase-4結(jié)構(gòu);D. OpsC3催化關(guān)鍵位點突變體在痢疾桿菌侵染細胞實驗中進行驗證。

　　中科院生物物理研究所丁璟珒研究員和北生所邵峰教授為本文的共同通訊作者，丁璟珒課題組侯彥婕博士和邵峰課題組生物物理所籍博士研究生曾歡為本論文的共同第一作者。該研究得到中科院倡議先導(dǎo)科技專項、科技部重點研發(fā)計劃、基金委優(yōu)青項目及中科院青促會項目的支持。