【摘要】 目的：研究5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺的抗氧化能力。方法：采用魯米諾化學(xué)發(fā)光法測(cè)定5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺清除羥自由基的能力;鄰苯三酚自氧化法研究5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺清除超氧陰離子自由基的能力。結(jié)果：5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺對(duì)?OH有清除作用，且呈現(xiàn)量效關(guān)系，其IC50為0.065 mg/mL;5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺對(duì)O-2.有清除作用，并呈濃度依賴性，當(dāng)濃度達(dá)到0.14 mg/mL 時(shí)， 對(duì)O-2.的清除率達(dá)到50% ， 當(dāng)濃度達(dá)到0.39 mg/mL時(shí)， 對(duì)O-2.的清除率達(dá)到80%。結(jié)論：5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺的水溶性很好，并且有較好的抗氧化能力。

　　【關(guān)鍵詞】 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺、抗氧化、羥自由基、超氧陰離子自由基

　　[ABSTRACT] Objective： To investigate the antioxidant capacity of 5,6 - dimethyl -2,3 - pyrazine amide. Methods： Luminol chemiluminescence and pyrogallol self-oxidation method were applied to detect the scavenging capacity of hydroxy radical and superoxide anion free radical. Results： 5,6 - dimethyl -2,3- pyrazine amide can scavenge?OH in a dose-effect way with IC50 of 0.065 mg/mL; it′s also capable of scavenging superoxide anion free radicals in a concentration -depended way. At a concentration of 0.14 mg/mL， the clearance rate of O2 was 50%， when it increase to 0.39 mg/mL the clearance rate can be as high as 80%. Conclusions： 5,6 - dimethyl -2,3 - pyrazine amide is water-soluble substance with great potential of antioxidant capacity

　　[KEY WORDS] 5,6 - dimethyl -2,3 - pyrazine amide; Anti-oxidation， Hydroxyl radical， Superoxide anion free radical

　　自由基是生命體活動(dòng)時(shí)所產(chǎn)生的一類活性分子，可被抗氧化劑或自由基清除劑中和。在正常代謝過(guò)程中，機(jī)體內(nèi)自由基的生成和消除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)中。但當(dāng)人體出現(xiàn)各種負(fù)荷狀態(tài)時(shí)，自由基的形成和消除之間的動(dòng)態(tài)平衡就會(huì)被破壞，過(guò)多的自由基將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷、病變和非正常死亡，從而誘發(fā)多種疾病。大量研究表明，炎癥、腫瘤、血液病、動(dòng)脈硬化、心臟病、老年癡呆、帕金森綜合征、肌肉硬化、白內(nèi)障乃至衰老等病變的產(chǎn)生與體內(nèi)自由基產(chǎn)生過(guò)多或自由基清除能力下降有著密切關(guān)系[1]。抗氧化劑或自由基清除劑能有效抑制或緩解自由基對(duì)機(jī)體的不利影響。因此，用于清除自由基防止脂質(zhì)過(guò)度氧化的抗氧化劑或自由基清除劑的研究已得到普遍關(guān)注。

　　許多含吡嗪環(huán)的化合物具有重要的生理活性，吡嗪類化合物在藥物上主要起抗結(jié)核，驅(qū)饒蟲(chóng)，抗驚厥，抗菌，清除自由基等重要作用。如四甲基吡嗪對(duì)兩種水溶液體系產(chǎn)生的O2.-和?OH的清除率分別為100%和44%[2]。本文在前期首次合成新化合物5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺[3]的基礎(chǔ)上，采用魯米諾化學(xué)發(fā)光法測(cè)定其清除羥自由基的能力及鄰苯三酚自氧化法研究其清除超氧陰離子自由基的能力。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　主要試劑與儀器

　　2,3-二氰基-5,6-二甲基吡嗪(Aldrich Co.)，Luminol(GR，ACROS試劑)，其他試劑均為市售分析純，所用水為二次蒸餾水。XT5顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(北京市科倫電光儀器廠);IFFM-E型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀，IFFS-A型多功能化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(西安瑞邁電子科技有限公司);722N型分光光度計(jì)(上海精密儀器公司)

　　1.1.2　5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺的合成[3]

　　將2,3-二氰基-5,6-二甲基吡嗪(0.474 g,0.03 moL)加到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的氫氧化鈉水溶液(48 mL)中，再加入丙酮32 mL，攪拌，于15 min內(nèi)滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的過(guò)氧化氫(20 mL)，升溫至50 ℃，繼續(xù)攪拌反應(yīng)，反應(yīng)現(xiàn)象為溶液顏色從棕褐色經(jīng)棕黃色、黃色變至透明淺黃，最后隨著反應(yīng)的進(jìn)行，顏色又逐漸加深直至變?yōu)樽睾稚?，約6 h后，停止反應(yīng)，于50 ℃以下蒸除丙酮，殘余物用甲醇12 mL洗滌，析出沉淀，抽濾，烘干，得黃色粉末狀固體0.5 g，收率85% 。m.p.256～259 ℃，與文獻(xiàn)[3]報(bào)道值一致。

　　1.2　方法

　　1.2.1　5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺的羥自由基清除效率的方法

　　采用魯米諾化學(xué)發(fā)光法測(cè)定5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺對(duì)羥自由基?OH的清除作用。分別用蒸餾水載流、15%的H2O2溶液、0.2 mmol/L Luminol溶液(用pH值為9.95,0.1 mol/L的Na2CO3- Na2HCO3緩沖溶液配制)及5， 6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺溶液泵入化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)(泵速為30 r/min)，記錄發(fā)光強(qiáng)度的峰值I，測(cè)定不同濃度的5， 6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺溶液對(duì)H2O2溶液-Luminol體系發(fā)光的抑制，(光電倍增管工作電壓為450，增益1)。以H2O2溶液-Luminol –碳酸鹽緩沖溶液為空白對(duì)照，測(cè)其發(fā)光強(qiáng)度I0,5， 6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺溶液對(duì)羥自由基的清除率(p)的計(jì)算公式為：　P=I0-II0×100%(Ⅰ)

　　1.2.2　5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺的超氧陰離子自由基清除效率的方法

　　用分光光度法測(cè)定樣品5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺對(duì)堿性鄰苯三酚體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基O2.-的清除作用。將5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺用水溶解(其水溶性很好)，配成1 mg/0.6 mL的濃度，取XμL(X=0、2、5、10、20、30、40)樣品液，加入到(1475-X)μL Tris-HCl緩沖液中(0.05 mmol/L，pH=8.2，含1 mmol/LEDTA)，再加25 μL鄰苯三酚溶液，迅速混合， 用722 N型分光光度計(jì)在325 nm 處測(cè)其吸光度，開(kāi)始計(jì)時(shí)從60 s開(kāi)始，此后每隔30 s讀數(shù)測(cè)一次吸光度值(325 nm)，到300 s為止。以Tris-HCl緩沖液為空白調(diào)零，0 μL樣品液為陽(yáng)性對(duì)照組。溫度為25 ℃時(shí)， 通過(guò)調(diào)整鄰苯三酚溶液濃度來(lái)控制其自氧化速率(以325 nm處吸光度的變化計(jì))約等于0. 070 min-1。5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺對(duì)O2.-的清除效率( S )由下式計(jì)算：S=K0-K1K0×100%=[(△A/△t)對(duì)照-(△A/△t)](△A/△t)對(duì)照×100%　(Ⅱ)式中， K0為鄰苯三酚自氧化速率， K1為加入5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺后鄰苯三酚的自氧化速率。

　　2　結(jié)果

　　2.1　5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺對(duì)羥自由基的清除

　　測(cè)定濃度分別為0.025、0.05、0.075、0.11、0.15、0.2、0.25的5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺溶液的發(fā)光強(qiáng)度I，見(jiàn)表1、圖1。表1　5， 6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺對(duì)?OH的清除率的測(cè)定圖1　5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺對(duì)?OH的清除

　　2.2　5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺對(duì)超氧陰離子自由基的清除

　　鄰苯三酚在堿性溶液中自氧化的吸光度A 與時(shí)間t 的關(guān)系如圖2 所示。室溫下測(cè)定不同質(zhì)量濃度的化合物對(duì)鄰苯三酚自氧化體系的影響：先作出不同濃度下鄰苯三酚自氧化的吸光度A 與時(shí)間t曲線，按式(Ⅱ)計(jì)算出該濃度下5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺的O-2.的清除效率(S)，再以濃度為橫坐標(biāo)，清除率S為縱坐標(biāo)，做曲線如圖3所示。圖2　領(lǐng)苯三酚在堿性溶液中自氧化吸光度A與時(shí)間t的關(guān)系圖3　5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺對(duì)超氧陰離子自由基的清除效率 (s)

　　3　討論

　　由表1及圖1可以看出，隨著5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺濃度的逐漸增加，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(I/I0)呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，而抑制率((I0- I)/I0)則呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，說(shuō)明5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺對(duì)?OH有清除作用，且呈現(xiàn)量效關(guān)系。其IC50(清除率為50%時(shí)溶液的濃度)為0.065 mg/mL，當(dāng)濃度為0.25 mg/mL時(shí)，其清除率達(dá)92%。

　　鄰苯三酚在弱堿條件下(pH=8.2)能迅速氧化，不斷反應(yīng)生成超氧陰離子自由基(O-2.)和有色中間產(chǎn)物，該有色化合物在325 nm波長(zhǎng)處有一特征吸收峰，吸光度值在反應(yīng)開(kāi)始一段時(shí)間之內(nèi)隨時(shí)間變化而線性增大。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，可以清除O-2.，從而阻止中間產(chǎn)物的積累，使鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在=325 nm處吸收峰值減小。在圖2中直線吸光度A1的斜率K 即為鄰苯三酚自氧化速率， 當(dāng)反應(yīng)體系中加入5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺(0.1 mg/mL) 后，體系的吸光度值A(chǔ)隨時(shí)間t的變化如圖2直線 吸光度A2所示， 直線斜率明顯降低，即5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺對(duì)O-2.有清除作用。圖3 表明5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺清除O-2.的濃度依賴性。 由圖3可知， 隨著濃度的增加， 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺對(duì)O-2.的清除作用增強(qiáng)，該化合物濃度達(dá)到0.14 mg/mL 時(shí)，對(duì)O-2.的清除率達(dá)到50% ，相當(dāng)于一個(gè)酶單位， 當(dāng)該化合物濃度達(dá)到0.39 mg/mL時(shí)，對(duì)O-2.的清除率達(dá)到80% ，與茶多酚清除O-2.的能力相仿，表明5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺是一個(gè)較好的O-2.的清除劑。

　　綜上所述，通過(guò)魯米諾化學(xué)發(fā)光法及鄰苯三酚自氧化法對(duì)5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺清除羥自由基及超氧陰離子自由基能力的測(cè)定表明， 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺有著較好的抗氧化能力，同時(shí)5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺有著很好的水溶性，從而為該化合物的可能應(yīng)用提供了一定的依據(jù)。

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